靶向巨噬细胞膜蛋白Vsig4特异性纳米抗体的构建和筛选

目的构建V-set and immunoglobulin domain containing 4(Vsig4)特异性纳米抗体,以期作为巨噬细胞的分子探针。方法用Vsig4重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与Vsig4蛋白结合的噬菌体,经测序和基因比对所得VHH序列,用ELISA法筛选出抗Vsig4的高亲和力纳米抗体,并用Vsig4稳定表达细胞系验证纳米抗体的结合能力。结果成功构建了插入率为70%、库容量为7.27×107的噬菌体表达文库,经过克隆筛选获得136个Vsig4阳性单克隆,经测序获得15个不同的VHH基因,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的Vsig4纳米抗体,其中Nb119的亲和力最高,并且可以与Vsig4稳定表达细胞系结合。结论成功构建并筛选了特异性、高亲和力的Vsig4纳米抗体,以期用于检测巨噬细胞表面Vsig4的表达和构建特异性分子探针。     

小鼠抗人T淋巴细胞表面抗原噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建并筛选小鼠抗人静息 /活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库。方法　以人静息 /活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞 ,RT -PCR扩增VH 和VK 基因 ,拼接为ScFv ,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌 ,构建了噬菌体展示抗体库 ,以人T淋巴细胞为靶抗原 ,对该库进行了 3轮淘洗 ,ELISA方法鉴定噬菌体抗体。结果　成功构建了最大实际库容量为 1 .75× 1 0 6的小鼠抗人静息T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库和小鼠抗人活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库。结论　所构建的抗体库可进一步用于对T淋巴细胞表面蛋白抗原的差异显示分析及构建基因工程抗体。     

Graves病自身免疫单链抗体库的构建及抗甲状腺单抗的筛选

目的　Graves病属于甲状腺自身免疫性疾病 (AITD) ,其患者血中存在多种抗甲状腺自身抗体 ,其中包括TGAb、TPOAb以及TRAb。单链抗体 (ScFv)是以连接肽将重链可变区基因 (VH)和轻链可变区基因 (VL)连接起来形成的单链小分子抗体。为了获得人源性抗甲状腺抗体 ,分析其基因结构 ,进一步研究AITD的发病机理 ,我们构建了人源性噬菌体ScFv库。方法　采取Graves病人静脉血 ,用淋巴细胞分层液按常规分离单个核细胞。提取淋巴细胞总RNA逆转录合成cDNA。分别扩增出全套的免疫球蛋白VL 链和VH 链基因 ,利用重叠PCR方法 ,构建ScFv基因。重组到 p3SCMH嗜菌粒中 ,电穿孔转化XL1 Blue大肠杆菌。经适当培养后 ,加入约 10 12 空斑形成单位 (PFU)的辅助噬菌体VCSM13,构建噬菌体抗体库。测定库容 ,鉴定重组率。以固相化的抗原对噬菌体ScFv库进行了 4轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,富集特异性噬菌体抗体。用ELISA竞争抑制实验检测富集的噬菌体抗体。结果　以单链cDNA为模板 ,用PCR方法分别扩增VL 链和VH 链的DNA。PCR产物经 15g·L-1琼脂糖电泳检测 ,分别在 380bp和 4 2 0bp左右见到扩增带。将VL 和VH 进行重叠PCR制备ScFv ,琼脂糖电泳显示PCR产物在 80 0bp左右有扩增带。将ScFv基因纯化 ,用SacⅠ+SpeⅠ双酶消化后 ,重组到 p3     

应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ABP37的反式调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建NS5ABP37反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选NS5ABP37蛋白反式激活相关基因.方法 以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ABP37转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,从转染后的细胞裂解液中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切消化后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应;第2次PCR产物与pGEM-T easy克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果 成功构建了人NS5ABP37蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库.扩增后得到60个200～1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得9种已知功能编码基因.结论 NS5ABP37基因功能涉及细胞生长调节、信号转导和能量代谢.     

多发性骨髓瘤MMSA-1抗原的二级结构预测及多克隆抗体的制备

目的 运用生物信息学技术研究人多发性骨髓瘤MMSA-1(GenBank:AY952881)基因表达蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,并制备多克隆抗体.方法 应用DNAStar Protean软件提供的模块分析和预测MMSA-1蛋白的二级结构和B细胞抗原表位.采用多通道同步固相全自动合成系统合成15肽,免疫健康新西兰成年家兔,制备相应的多克隆抗体.结果 MMSA-1蛋白含有较多的β折叠和转角结构.综合柔韧性、亲水性、抗原性、表面可能性、二级结构、偶联难易及实验难度等因素,选取了MMSA-1蛋白序列318～333位作为抗原表位,即SSSLLPQSPAPTEHL,15肽合成产物经HPLC纯化和质谱检测,纯度达到98.65%,序列正确.免疫兔子获得血清抗体采用层析柱纯化,ELISA检测效价:1∶6000.结论 本研究为基于人MMSA-1抗原表位手段的免疫治疗研究提供了理论依据.     

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的　为构建人乳头瘤病毒 1 1型 (HPV1 1 )DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法　利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA ,采用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因克隆。结果　从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 1 1型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体T easy中构建重组质粒 ,转化JM1 0 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。结论　该实验的成功为下一步制备HPV1 1的治疗性疫苗奠定基础。     

抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法　在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论　获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础     

葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在筛选致敏蛋白组分的应用

目的制备、鉴定兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体,并初步应用于葎草花粉致敏蛋白组分的筛选。方法用葎草花粉变应原浸液免疫兔,获得高效价抗葎草花粉蛋白抗血清,应用琼脂免疫双扩散、ELISA法以及Western blotting鉴定产生的抗体。同时对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行Western blotting检测。结果兔抗血清效价经ELISA检测,效价>1∶10000,免疫双扩散结果表明抗血清只与葎草花粉变应原形成特异性IgG沉淀线,Western blotting检测兔抗血清IgG可以特异性识别葎草花粉8种蛋白组分,分子质量分别为100、88、76、69、65、55、49、38 ku,患者血清IgG可以识别5种蛋白组分,分子质量分别为100、76、55、493、8 ku。结论制备的兔抗血清具有较高效价和较好的特异性,应用该血清筛选出的葎草花粉致敏蛋白组分与患者血清筛选的组分相似,因此可进一步应用于初筛cDNA表达文库。     

用体外致敏联合EB病毒转化技术构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库

目的构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库。方法体外致敏并用EB病毒(EBV)转化肝癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。RT-PCR扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,将抗体基因分别与载体pComb3连接后,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建噬菌体呈现型Fab抗体库。结果经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生;经PCR扩增出13条轻链基因片段(κ、λ)和28条重链Fd基因片段(γ);电转化构建的噬菌体抗体库库容为1.7×107puf/mL;Fab基因的重组率约为100%。结论用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,成功构建了全人源抗肝癌Fab组合抗体文库。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3全长基因的克隆和表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3,为进一步研究其基因功能奠定基础。方法设计特异性引物,以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因。将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,经酶切、PCR及测序鉴定后,与表达载体pET32a重组,后转入BL21菌株并诱导表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS3基因的蛋白表达水平。结果含有NS3的重组体构建成功并在大肠杆菌中表达。结论运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV非结构基因NS3蛋白,为尽一步研究HCVNS3基因功能奠定了基础。     

TAT-BACEsp-GFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建穿膜肽基因和BACE底物肽融合基因与绿荧光融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础.方法 利用非对称互补引物/模板法制备两端含有酶切位点的TAT-BACEsp融合基因的cDNA,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实获得的TAT-BACEsp产物与设计的完全吻合;TAT-BACEsp准确克隆入FUGW的多克隆位点.结论 成功构建了TAT-BACEsp与GFP 融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗提供了适合的稳定转染的载体.     

抗人CD3单链抗体四聚体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　将抗人CD3单链抗体 (scFv) /人 p5 3四聚功能域融合基因转染到HeLa细胞 ,进行真核表达和活性测定。方法　将抗人CD3scFv /人 p5 3四聚功能域融合基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Westernblot证实 ,为Mr约35 0 0 0的特异蛋白条带。纯化后经流式细胞仪检测 ,可特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMCs) ,亲和力高于scFv。结论　获得了可与PBMCs特异性结合的抗人CD3scFv四聚体 ,为进一步临床应用奠定了基础     

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的　分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法　采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果　成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。结论　中国人宫颈癌HPV16E6基因结构有一定的变异