榄香烯联合三苯氧胺对乳腺癌MCF-7细胞株的抑制效应

目的观察榄香烯和三苯氧胺对乳腺癌细胞的抑制效应,尤其是两者联合应用有无协同增效作用。方法将MCF-7细胞培养于RPMI1640培养基中,置入37℃,100%湿度,5%(体积分数)的CO2培养箱内。接种细胞并加入实验药物,用CCK-8法检测三苯氧胺联合榄香烯对细胞的增殖抑制效应,用酶标仪在450nm测量每孔吸光度值,计算每组细胞抑制率。结果无毒剂量的榄香烯与治疗剂量的三苯氧胺联合应用,吸光度均值较单用三苯氧胺明显下降,并且相应的细胞抑制效应较单用组明显上升。结论无毒剂量的榄香烯能够使三苯氧胺对乳腺癌细胞的抑制效应显著增强,提示榄香烯与三苯氧胺联合应用具有协同作用。     

小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法

目的建立一种操作简便、高纯度的小鼠背根神经节神经细胞原代培养的方案。方法取6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠的背根神经节,使用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化,获取背根神经节神经细胞,采用小鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定并测定细胞纯度。结果培养的原代神经细胞生长良好,纯度可达90%,用含有神经生长因子(NGF)的DMEM培养基培养,存活时间可达60 d。结论该方案简单稳定,可培养出大量高纯度的神经细胞,为深入研究神经细胞提供了可靠的模型。     

大鼠脉络丛上皮细胞的原代培养与鉴定

目的建立一种简便、实用的大鼠脉络丛上皮细胞的原代培养方法,以便进一步对其进行体外实验研究。方法无菌条件下取1～9d的Sprague-Dawley大鼠脉络丛组织,经机械分离后将细胞种植于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中进行培养,定期进行形态学观察并摄片。在培养第9天左右,采用电子显微镜及Hematoxylin&Eosin(HE)染色进行形态学观察,免疫细胞化学染色法鉴定并计算脉络丛上皮细胞的纯度。结果培养的脉络丛上皮细胞呈梭形或多角形,电子显微镜下有微绒毛,细胞纯度在95%以上。结论利用机械分散法分离新生大鼠脉络丛上皮细胞,进行原代培养可获得高纯度的脉络丛上皮细胞,该方法简便实用。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其形态观察

目的　分离和培养大鼠骨髓组织中的间充质干细胞 ,并观察其生长形态。方法　利用造血干细胞和骨髓间充质干细胞不同生长特性 ,采用贴壁法分离并用含 15 % (体积分数 )FBS的低糖型DMEM培养基培养。结果　分离培养得到的细胞中随着换液次数的增加红细胞和造血细胞逐渐减少 ;骨髓组织中贴壁得到间充质干细胞呈梭形、纺锤形和多角形。结论　贴壁法可以分离培养骨髓中的间充质干细胞     

白细胞介素2诱生和检测的实验条件分析

本文对人外周血单个核细胞(PBMC)诱生白细胞介素2(IL-2)及用ConA 激活的小鼠脾细胞检测IL-2活性过程中的几个实验条件进行了摸索,发现1×10~6 PBMC/ml 经10ug ConA/ml 刺激48h 为诱生IL-2的最佳条件,检测IL-2活性的最佳条件是:2.5×10~4每孔检测细胞/0.1ml/与等量样品共同培养24h.作者认为,小鼠脾细胞经10ug ConA/ml 剌激48h 后.大部分转化为淋巴母细胞,适用于IL-2活性的检测,并具有一定的特异性和重复性。     

乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化及血管形成的实验研究

目的探讨乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化的潜力及参与肿瘤血管形成的作用。方法收集人乳腺癌组织样本,检测肿瘤血管中突变型P53、CD31、VEGF的表达及Her-2扩增;制备乳腺癌单细胞悬液,分选出CD44~+/CD24-/low细胞,以培养体系为EGM-2内皮细胞培养基培养,检测其内皮细胞表面标志CD31和CD105的表达和摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力,体外进行三维胶培养,观察其脉管样结构。结果乳腺癌组织样本中均可观察到CD31、VEGF、突变型P53的表达,并沿着血管腔或血管球排列;免疫荧光显示乳腺癌组织血管内表达CD31和DAPI信号;在13例所取样本中检测到Her-2阳性扩增4例,未扩增9例。分离成功的乳腺癌干细胞进行免疫磁珠分选,分选前CD44~+细胞比例[(7.5±2.6)%]明显低于分选后[(94.3±4.7)]%,差异具有统计学意义(P<0.05);分选前CD24~+细胞比例[(48.2±9.4)%]明显高于分选后[(4.3±1.6)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。乳腺球细胞中CD105~+细胞比例为(4.5±0.9)%,CD31~+细胞比例为(6.2±1.3)%;经内皮细胞培养体系持续培养3代后,CD105~+和CD31~+细胞比例分别为(79.6±9.3)%和(84.1±10.7)%,差异有统计学意义(P<0.05)。经内皮细胞培养体系培养后的细胞能吞噬DiL-Ac-LDL,内皮细胞组可见有脉管样结构形成,而对照组无脉管样改变的趋势。结论乳腺癌干细胞来源的内皮细胞可分化为血管内皮细胞并具有脉管形成的能力,提示乳腺癌干细胞可能参与肿瘤血管的形成。     

血管抑素对胰腺癌血管生成的抑制作用

目的观察血管抑素在胰腺癌血管生成中的作用。方法采用Lipofectamine 2000基因转染技术将真核表达载体pcDNA3.1(+)-angiostatin导入人胰腺癌PC-3细胞,筛选阳性克隆并扩大培养。PC-3细胞分为血管抑素转染组、空白对照组及脂质体对照组,分别检测各组血管抑素蛋白表达;利用显微镜下细胞计数法测定转染前后PC-3细胞的体外生长曲线;检测各组PC-3细胞培养上清所分泌的血管抑素对血管内皮细胞ECV-304增殖的影响。进一步建立种植瘤模型,通过CD34染色法检测Angiostatin对种植瘤中血管密度的影响。结果 Western blotting检测显示血管抑素转染组的PC-3细胞可分泌血管抑素,而空白对照组及脂质体对照组的PC-3细胞无血管抑素的分泌;细胞生长曲线显示,血管抑素转染组、空白对照组及脂质体对照组的细胞生长速度和倍增时间无明显差异;3组PC-3细胞上清液对内皮细胞ECV-304的生长有明显差异,血管抑素转染组的生长明显低于空白对照组及脂质体对照组。体内试验显示血管抑素转染组的种植瘤生长明显低于空白对照组及脂质体对照组。血管抑素转染组的种植瘤微血管密度(19.6±3.6)显著少于空白对照组(48.5±4.7)和脂质体对照组(51.1±5.4)。结论血管抑素可抑制血管内皮细胞的增殖,进一步产生抑制胰腺癌血管生成效应。     

兔动员外周血间充质干细胞集落形成能力与神经元诱导分化研究

目的研究动员后兔外周血间充质干细胞(PBMSCs)的存在频率,并对PBMSCs进行神经元诱导分化鉴定。方法采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)皮下注射动员,结合密度梯度离心和贴壁培养法分离、培养兔外周血样品中的PBMSCs,利用集落形成率分析动员兔PBMSCs的存在频率,并对PBMSCs的神经元分化能力进行体外诱导鉴定。结果动员后的PBMSCs原代培养24h后,可见较多短梭形及多角形贴壁细胞,3～4d后出现集落样生长,传代培养的PBMSCs形态均一、呈长梭形漩涡状生长;未动员的外周血样品中的贴壁细胞少,集落形成少,且易老化,无法传代。集落形成率实验显示,动员后的PBMSCs在每百万外周血单个核细胞中有2.8～10.8个;而未动员组PBMSCs仅有0～3个。免疫细胞化学染色显示,PBMSCs经神经诱导7d后其神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元特性核蛋白(NeuN)染色阳性。结论动员剂可提高兔外周血中的PBMSCs含量,所获取的PBMSCs具备神经元分化能力。     

尿激酶减轻草酸诱导的MDCK细胞脂质过氧化损伤的实验研究

目的观察尿激酶(UK)能否减轻草酸对体外培养的狗肾小管上皮细胞(MDCK)的损伤作用,探讨UK在尿路结石防治中的作用及其机制。方法培养正常MDCK细胞,在原代培养第5天时,随机分为3组(空白组、草酸组、UK组),分别加入正常培养液、含有草酸(5mmol/L)的培养液及含有草酸(5mmol/L)和UK(10万U)的培养液,于2h后分别测定各组细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)的水平;于0.5、1、1.5、2h时采用CCK-8检测细胞活力;倒置显微镜下观察细胞表面晶体的粘附情况。结果①草酸组和UK组细胞培养基中LDH与MDA含量均明显高于对照组(P<0.05);与UK组相比,草酸组细胞培养基中LDH及MDA含量更高(P<0.05);②各组细胞活力均有所下降,UK组相对于草酸组下降幅度更显著。③倒置显微镜下UK组草酸钙晶体于细胞表面粘附程度明显轻于草酸组。结论 UK能够减轻草酸对MDCK细胞的损伤及晶体的粘附,从而抑制结石的形成。     

MDM2/p53通路对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡的调控

目的研究MDM2/p53通路对多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的调控作用及机制。方法体外培养人MM细胞株(RPMI 8226)并分为实验组(Nutlin-3a)和对照组(药物溶剂),采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况和抑制率,Western blot检测凋亡相关蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,24、48、72 h时间点实验组细胞增殖明显降低,抑制率明显增高(P<0.05);实验组MDM2和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),而p53的表达水平明显升高(P<0.05)。实验组各时间点凋亡率(38.42%、82.26%、82.74%)均明显高于对照组(4.80%、8.06%、14.69%)。结论 MDM2与p53之间构成降解-反式激活循环通路影响下游凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,抑制MM细胞的增殖,促进MM细胞凋亡。     

阳离子聚合物介导的体外培养兔角膜内皮细胞基因转移

目的观察非病毒载体阳离子聚合物(SofastTM)介导的编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pEGFP-N1和pIRE-EGFP两种质粒对体外培养的兔角膜内皮细胞(RCEC)的转染效率和转染前后细胞Na+-K+-ATPase活性变化,探索最优的体外RCEC非病毒载体基因转移条件。方法消化法原代培养RCEC,SofastTM与pEGFP-N1和pIRE-EGFP两种质粒按不同比例混合,介导此两种质粒转染RCEC,分别比较各质粒不同时间的转染效率,并检测转染与未转染细胞Na+-K+-ATPase的活性以确定基因转移对RCEC活性的影响。结果SofastTM与质粒(pEGFP-N1和pIRE-EGFP)按不同比例转染RCEC后,24-48 h均有EGFP的表达。SofastTM∶pEGFP-N1=3.2∶1组在转染后48 h时转染效率最高(P<0.05),为3.6%。SofastTM∶pIRE-EGFP=3.2∶1组在转染后24 h时转染效率最高(P<0.05),为3.5%。转染与未转染组细胞数和细胞Na+-K+-ATPase活性均无明显差异。结论SofastTM可有效介导以pEG-FP-N1和pIRE-EGFP为载体的外源基因向体外培养的RCEC转移,且基因转移后RCEC活性不受影响。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞间质合成的影响

目的　观测血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛小梁细胞间质合成的影响 ,探讨原发性开角青光眼的发病机制。方法　①体外培养牛眼小梁细胞 ,应用免疫组化方法 (NSE ,Ⅷ因子相关抗原染色 )鉴定细胞 ,光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察 ;②AngⅡ (1×1 0 -7mol·L-1及 1× 1 0 -8mol·L-1)及其Ⅰ型受体拮抗剂孵育牛眼小梁细胞 ,免疫荧光染色测定纤维粘连蛋白 ,并用化学方法检测培养液中羟脯氨酸含量间接推导胶原含量。结果　牛眼小梁细胞培养成功 ,以上皮型为主。AngⅡ明显地增加了牛眼小梁细胞纤维粘连蛋白 ,同时培养液中的羟脯氨酸含量亦相应增高 (P <0 0 5 )。结论　体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术。AngⅡ可以促进纤维粘连蛋白、胶原合成增强 ,AT1受体拮抗剂可以部分阻断此促增殖效应。     

体外诱导人脐血CD34~+细胞向肝细胞的分化

目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50 mL/L FBS,1×ITS,4.7 mg/L亚油酸,10-4mol/L 2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16 d时留取细胞。通过RT-PCR对ALB、AFP、GATA-4等mRNA的表达水平进行检测;用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达,并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%,达到分离要求。RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16 d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞,ELISA检测表明诱导组8、16 d培养液中的ALB质量浓度明显增高,与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论在体外培养条件下,脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。     

早期人胚神经干细胞分布及分离培养

目的　研究发育早期人胚脑神经干细胞的形态特征及其分布情况 ,并观察其体外生长分化特性。方法　计划生育流产的 6～ 12周胚胎大脑组织切片用vimentin抗体进行免疫组织化学染色 ,光镜观察。机械分离皮质细胞 ,用无血清培养基和含血清培养基进行悬浮和贴壁培养 ,分别用MAP2 、GFAP及GalC抗体进行免疫细胞化学染色 ,鉴定干细胞和神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结果　发育早期大脑Vimentin阳性细胞分布广泛 ,细胞形态单一 ,多呈圆球形 ,体积较小。体外培养的大脑皮质细胞在培养的第 5～ 7天时 ,形成较多克隆 ,可多次传代 ;贴壁培养时细胞发生分化 ,分别为MAP2 、GFAP、GalC阳性的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结论　胚胎发育早期大脑神经干细胞分布广泛 ,形态单一 ,皮质Vimentin阳性细胞数量多 ,便于分离 ,是最佳神经干细胞分离部位 ;人NSCs可以在体外增殖并发生多向分化     

Induction of apoptosis and inhibition of proliferation of C6 glioma cells in vitro by tamoxifen

Objective To investigate the anti-tumor effect and mechanism of tamoxifen on rat C6 glioma cells. Methods C6 cells were cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium （DMEM） with 3% fetal calf serum （FCS）, and treated with tamoxifen of different concentrations, i.e. group A （1.25 μmol/L）, group B （2.50 μmol/L）, group C （5. 00 μmol/L）, group D （10. 00 μmol/L）, group E （20. 00 μmol/L） and control group （0. 00 μmol/L）. Morphological changes, MTT assay and 5-bromo-2＇-deoxyuriding labeling ratio were assessed. Apoptosis was observed by flow cytometry. Results C6 cells treated with different doses of tamoxifen for 24, 48, and 72 hours became irregular in shape, while cells treated with vehicle grew normally. MTT assay showed that tamoxifen did not suppress C6 cell growth until 72 hours after treatment. Seventy-two hours after treatment, there were significant differences in cell viable rate between group A versus groups C, D and E; so did group B versus group D as well as group E （P〈 0.05 ）. BrdU incorporation assay indicated significant difference of BrdU labbled index （BrdU LI） among groups A, C, E and control group 48 hoers after treatment （P〈0.05）. And the BrdU LI decreased with the increased concentration of tamoxifen. Flow cytometry （FCM） showed significant difference between treated group and control group at 24, 48, and 72 hours after treatment （P〈0.05）. Conclusion Tamoxifen significantly suppresses the growth of C6 glioma cells in a time- and dose-dependent manner. The mechanism of tamoxifen suppressing C6 glioma cells may be inhibiting proliferation and inducing apoptosis. Therefore, tamoxifen can be a candidate as a chemotherapy agent for glioma.     

丹参酮ⅡA对人肝癌细胞Ang-2及其受体Tie-2表达的影响

目的观察丹参酮ⅡA对人肝癌SMMC-7721细胞株Ang-2及其受体Tie-2表达的影响,探讨其抗癌的作用机制。方法体外培养肝癌SMMC-7721细胞株,经不同浓度丹参酮ⅡA作用后,MTT方法测定细胞增殖,免疫细胞化学法测定Ang-2及其受体Tie-2表达,ELISA法检测细胞培养液中Ang-2和VEGF水平。结果丹参酮ⅡA对肝癌细胞的生长有明显抑制作用,并呈剂量依赖性。免疫细胞化学检测显示,随着丹参酮ⅡA作用浓度的增大,Ang-2及其受体Tie-2表达下调,其在1.0μg/mL组作用48h的高表达率分别为33.33%、40.00%,灰度值分别为167.43±12.44和169.05±15.59,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);ELISA法检测显示,丹参酮ⅡA作用组细胞培养上清液中Ang-2和VEGF含量明显下降。结论抑制Ang-2及其受体Tie-2表达可能是丹参酮ⅡA抗肝癌作用的机制之一。     

大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响

目的 研究中药大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响.方法 体外培养肝细胞株HL-7702,随机分为对照组和大黄素处理组.对照组未予大黄素处理,大黄素处理组按100、10、1 μmol/L分为高、中、低3个浓度组,建立模拟冷缺血再灌注模型,流式细胞技术检测各组细胞内钙离子浓度及细胞凋亡水平,分别检测各组细胞培养上清液乳酸脱氢酶水平.结果 冷缺血8 h再灌注6 h后,高、中、低浓度大黄素处理组钙离子荧光强度分别为(24.12±0.51)、(26.35±1.34)、(39.12±1.94),均显著低于对照组的105.29±1.01(P<0.01).高、中、低浓度大黄素处理组细胞凋亡率分别为(5.46±0.41)%、(10.64±0.64)%、(11.90±0.50)%,均显著低于对照组的(25.40±1.41)%(P<0.01).高、中浓度大黄素处理组上清液LDH含量分别为(179.67±18.57)u/L、(198.83±14.22)u/L,显著低于对照组的(351.33±34.16)u/L(P<0.01).结论 大黄素可降低模拟冷缺血再灌注后的肝细胞内钙离子浓度,抑制细胞凋亡,减轻肝细胞损伤.     

EFFECTS OF TOTAL SAPONINS OF PANAX NOTOGINSENG AND LIGUSTRAZINE ON THE PROLIFERATION OF CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS OF RATS

Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ (ＥＣｓ)ｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｔｈｅｂａｒｒｉｅｒｏｆｔｈｅｂｒａｉｎａｎｄｒｅｌａｔｅｔｏｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｓｏｍｅｅｎｄｏ ｃｒｉｎｅｓ.Ｔｈｅｉｒｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓ[1] .ＤａｍａｇｅｔｏＥＣｓｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｓｉｇｎａｎｄａｂａ ｓｉｃｆａｃｔｏｒｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ .Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ,…     

尿激酶对胸膜成纤维细胞分泌转化生长因子-β1的影响

目的探讨胸膜成纤维细胞(FB)分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)的作用及尿激酶(UK)对其分泌作用的影响。方法取健康雄性SD大鼠胸膜,培养、纯化并鉴定FB。设对照组和实验组。对照组分为2个亚组:对照0组由不含胸膜FB的24个样本组成,加入无血清的RPMI 1640培养液;对照1组由24个胸膜FB样本组成,加入无血清的RPMI 1640培养液,培养24 h后,用酶联免疫吸附法测定上清液中TGF-β1的含量。实验组分为4个亚组,共24个样本,分别加入5 000(A组)1、0 000(B组)、20 000(C组)和30 000 IU/mL(D组)的UK,培养24 h后取上清液,测定TGF-β1的含量。结果胸膜FB分泌TGF-β1的量为(3035.655±394.975)ng/L;A、B、C、D组(5 000-30 000 IU/mLUK)对TGF-β1均有抑制作用,A组与B、C、D组之间比较有显著性差异(P<0.01),但B、C、D组之间比较无显著性差异(P>0.05)。对照0组未检测出TGF-β1。结论胸膜FB能分泌TGF-β1,UK能抑制其分泌。     

氟对体外器官培养人牙胚骨形成蛋白表达的影响

目的　通过研究氟对牙胚发育早期骨形成蛋白 (BMP)表达的影响 ,初步探讨氟在早期牙胚发育中的可能作用机制。方法　 4个月的人胚胎 ,取乳牙胚用RPMI16 4 0培养液进行器官培养 8d。免疫组化法研究 2 5mg·L-1和 5 0mg·L-1的氟对分泌前期牙胚的影响 ,观察培养第 2、4、6、8天时BMP表达的变化。采用图像分析仪对免疫组化染色结果进行灰度分析。结果　BMP的表达主要在造釉器。成釉细胞 ,中间层细胞和星网状层细胞均有BMP表达 ,牙乳头细胞或成牙本质细胞不表达BMP。 2 5mg·L-1氟时从培养第 6天开始BMP表达增强 ;5 0mg·L-1氟时从培养第 2天到第 6天BMP的表达增强 ,培养第 8天时BMP的表达降低。结论　氟可能通过促进BMP某一亚型或某几个亚型的表达而在牙胚发育中起作用