葎草花粉变应原的研究进展与展望

变态反应性疾病是世界范围内重大卫生问题之一,近50%的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。葎草在我国分布广泛,是引起花粉症的主要致敏物之一。葎草花粉症患者呈逐年上升趋势,已受到人们广泛关注。本文从葎草花粉的致敏状况、主要致敏蛋白组分、葎草花粉症诊断和治疗方法的建立以及主要变应原重组等方面进行综述。     

葎草花粉cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建葎草花粉cDNA表达文库,为进一步筛选葎草花粉的主要致敏蛋白组分、制备重组变应原奠定基础。方法采集新鲜葎草花粉,过筛后液氮保存,利用Trizol法抽提葎草花粉总RNA,纯化后PCR法反转录合成cDNA。经SfiⅠ酶切,过凝胶柱层析,去除小于400 bp的片断,收集大于400 bp的cDNA片段,加工后与λTripIEx2连接,文库体外包装,取出一小部分感染宿主菌XL1-Blue MRF,检测文库容量;PCR分析插入的cDNA片段的大小及多样性。结果成功构建一个含有5×105重组子的葎草花粉表达文库,重组率为90%,平均插入片段长度约为1.02 kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选克隆的目的cDNA。     

法国梧桐花粉的部分纯化及其主要变应原免疫活性分析

目的　对法国梧桐花粉变应原进行部分纯化并对其主要变应原免疫活性进行分析。方法　采用凝胶层析法分离纯化法国梧桐花粉变应原 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的主要峰段的蛋白质分子质量 ,并对 7例法国梧桐花粉过敏支气管哮喘患者血清进行免疫印迹分析。结果　法国梧桐花粉变应原粗制液经SephadexG 10 0层析柱洗脱得两个洗脱峰 ,第一峰及第二峰升段富含蛋白 ;收集各段进行SDS PAGE电泳 ,第一峰升段、峰段、降段电泳图相似 ,主要含分子质量为 2 2～ 71ku之蛋白质 ,第二峰升段以分子质量为 14～ 16ku之蛋白质为主。电泳结果清晰显示 6条蛋白区带 ,分子质量分别为 71、5 0、35、39、2 2、16ku。免疫印迹分析可见 4条sIgG反应带 ,分子质量为 5 0、39、2 2、16ku。结论　法国梧桐花粉变应原含 6种主要蛋白成分 ,第一峰蛋白质含量高 ,为主要致敏组分 ;第二峰蛋白质含量少 ,为次要致敏组分。     

葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的构建及其免疫原性鉴定

目的 构建葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA-LC2并鉴定其免疫原性.方法 将pTripIEx2-LC2质粒用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切得到LC2葎草花粉变应原基因片段,将其插入pcDNA3.1(-)真核表达载体,在鉴定重组质粒构建成功后,大量制备去内毒素核酸疫苗pcDNA3.1-LC2,应用pcDNA3.1-LC2核酸疫苗免疫小鼠,取免疫血清行双向免疫扩散实验,分析其免疫原性.结果 通过测序确认构建pcDNA3.1-LC2中的672bp的编码框碱基与原序列一致,没有突变及缺失.应用pcDNA3.1-LC2免疫BALB/c小鼠,经双向免疫扩散试验验证pcDNA3.1-LC2在小鼠体内可以表达并产生特异性抗体.结论 成功的构建了葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2,pcDNA3.1- LC2可在小鼠体内表达,并能产生葎草花粉变应原特异性抗体,具有良好的免疫原性.     

葎草花粉致敏的小鼠肺部变应性炎症模型的建立

目的 建立葎草花粉粗浸液致敏激发的小鼠肺部变应性炎症模型.方法 24只BALB/c小鼠随机平均分为正常对照组和哮喘模型组.观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比;HE染色观察葎草花粉粗浸液激发小鼠肺部变态反应性炎症;酶联免疫吸附试验检测BALF、脾组织匀浆中的细胞因子及血清总IgE抗体.结果 与正常对照组比较,模型组可诱导肺组织出现明显的变应性炎症,且病理炎症评分有统计学差异(P<0.01);BALF中的细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)计数、IL-4,脾脏重量,脾组织匀浆IL-4和血清总IgE抗体均显著高于正常对照组(P<0.01).结论 葎草花粉粗浸液能够成功建立小鼠肺部变态反应性炎症模型.     

致过敏性哮喘的葎草花粉特异性变应原pTSX1 cDNA克隆的生物信息学分析

目的 对免疫学筛选鉴定获得的葎草花粉过敏哮喘特异性变应原阳性pTSX1 cDNA克隆进行生物信息学分析.方法 运用生物信息学的序列分析、序列比对、基因构成和蛋白质的结构及功能进行预测.结果 pTSX1 特异性变应原克隆序列分析表明,该克隆与现有的已知基因均无高度同源性.其序列有一615bp的开放阅读框(61～675bp),编码204个氨基酸.预测pTSX1蛋白的氨基酸序列编码蛋白很有可能为核糖体蛋白.结论 获得的葎草花粉过敏哮喘特异性变应原阳性pTSX1 cDNA克隆是一个新的基因,pTSX1基因编码的蛋白可能是核糖体蛋白.     

西安市气传花粉调查

目的 调查西安市气传花粉的种类、数量及季节消长规律的特点,为当地花粉症的防治提供依据.方法 在西安市设置了3个花粉收集点,采用重力沉积法收集花粉,并对花粉形态进行观察和鉴定,历时1年.同时进行了广泛的野外植被调查,制作植物标本及标准花粉片,并对168例过敏性哮喘患者进行花粉变应原筛查.结果 全年3个花粉收集点共收集花粉13820粒,其中市中心4103粒、东郊4305粒、西郊5412粒,可归为33科、42属、33种.按花粉数量依次为杨属、松科、柏属、构属、蒿属、榆属、法桐、葎草、藜属等.植被调查发现,西安市绿化植物以杨树、柳树、松树、柏树、法桐为主,郊区杂草以艾蒿、葎草、藜草、禾本科植物为主.变应原筛查阳性率依次为艾蒿、法桐、藜草、葎草、禾本科.西安市气传花粉每年出现春季(3～5月)、秋季(8～9月)2个飘逸高峰期,春季以杨属、松科、柏属、构属、法桐等木本植物花粉为主,秋季以蒿属、葎草、藜草等草本植物为主.结论 艾蒿、法桐、藜草、葎草、禾本科可能系西安市的主要致敏花粉.提前对花粉变应原筛查阳性者进行特异性免疫治疗对控制哮喘发作极为重要.     

抗鸭乙肝病毒core蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗鸭乙肝病毒core蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。方法 PCR扩增鸭乙肝病毒(DHBV)core基因片段,构建表达载体pET28a(+)/DHBV core。转化诱导表达融合蛋白,用Ni 2+亲和柱纯化目的蛋白。免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选,采用有限稀释法筛选单克隆杂交瘤细胞并进行细胞克隆。体内诱生法大量制备单克隆抗体,进行抗体的特异性、效价和亚型的鉴定。结果成功构建表达载体pET28a(+)/DHBV core,并表达DHBV core蛋白。获得2株稳定分泌抗DHBV core抗体的杂交瘤细胞株,分别为2D7和5G10,细胞培养液抗体效价为1∶400和1∶800。选择5G10细胞株制备单克隆抗体,小鼠腹水抗体效价可达1∶320 000。鸭肝组织免疫组化结果显示,DHBV病毒载量>1010copies/mg的肝组织中DHBV core蛋白的表达明显高于病毒载量<105copies/mg的肝组织,而未感染DHBV的鸭肝细胞内不表达DHBV core蛋白。亚型鉴定结果为IgG2aκ链。结论制备并获得了抗DHBV core蛋白的单克隆抗体,为DHBV core蛋白的功能研究、诊断试剂的研制与抗病毒治疗研究奠定了基础。     

抗哇巴因多克隆抗体的制备及免疫周期和剂量的研究

制备抗哇巴因多克隆抗体 ,探讨最佳的免疫周期及免疫剂量。应用哇巴因 (ouabain) -牛血清白蛋白 (BSA)结合物为抗原免疫家兔 ,每周从兔耳缘静脉采血 ,监测哇巴因特异抗体的产生 ;以0 .2 5mg/次、1mg/次、1.75mg/次、2 mg/次四种不同免疫剂量进行最佳免疫剂量的研究。 5个月后颈动脉取血 ,进行抗体效价、亲和力及特异性的检测。结果显示免疫间隔为 6周、免疫剂量为 1.75mg/次时可以获得高效价、高亲和力和高特异性的哇巴因抗血清。     

哮喘斜纹天蛾及蛱蝶致敏原的临床研究

应用自己研制的斜纹天蛾及蛱蝶变应原给31例哮喘患者做皮肤试验及BSA－ELISA特异性IgE测定，研究两种常见昆虫的致敏性。结果发现哮喘患者斜纹天蛾及蛱蝶的皮肤试验及特异性IgE阳性率均明显高于正常人（P＜0．01），其OD指数均值亦明显高于对照组（P＜0．01）。提示斜拉天蛾及蛱蝶可能系哮喘致敏原，建议将这两种新发现的昆虫变应原用于哮喘病因学诊断及特异性免疫治疗中。研究还显示哮喘皮肤试验与特异性IgE阳性符合申70％以上，正常对照组无1例特异性IgE阳性，提示皮肤试验与BSA－ELISA均为诊断斜纹天蛾及蛱蝶过敏理想的方法，但后者特异性更强，更安全、可靠。     

Polyclonal antibody preparation and expression in liver tissues of transactivated protein 5 of hepatitis C virus nonstructural 5A

Objective To prepare polyclonal antibody of transactivated protein 5 of hepatitis C virus nonstructural 5A (NA5ATP5) and to explore its expression in the liver tissues. Methods In Escherichia coil BL21, the prokaryotic expression vector pET32a(+)-NS5ATP5 was induced by isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), and it was analyzed with sodium dodecyl sulfate-polyaerylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting. And the purified protein was used to immunize the rabbit to prepare polyelonai antibody, with which we studied the function of NSSATP5 by determining the different liver tissues with the streptavidin-perosidase (SP) immunohistochemistry method. Results Recombinant NS5ATP5 (molecular weight: 65 kD) and polyclonal antibody were successfully prepared. NS5ATP5 expression in the liver of patients with chronic HCV infection was much higher than that of a normal person, and it was detected mainly in the cytoplasm. Conclusion The findings of the expression difference between HCV patients and normal people led to a novel diagnostic marker to detect HCV infection.     

结核蛋白芯片对肺结核及肺外结核的诊断价值

目的通过临床诊断和医学检验报告,评价了结核蛋白芯片在肺结核及肺外结核中的辅助诊断作用。方法应用蛋白芯片对107例肺结核患者及134例肺外结核患者进行结核菌蛋白16ku、38ku和脂阿拉伯甘露糖(LAM)的相应抗体的检测。结果①结核蛋白芯片对结核病的诊断有辅助诊断的价值。②联合三项蛋白芯片抗体指标(16ku蛋白、38ku蛋白、LAM)进行辅助诊断肺结核的价值大于辅助诊断肺外结核的价值,其中肺结核组结核蛋白芯片阳性率为66.4%,肺外结核组阳性率35.8%。③在结核病中三项蛋白芯片抗体指标灵敏性依次为LAM、38ku蛋白、16ku蛋白。④联合蛋白芯片指标灵敏性高于单一蛋白芯片指标。⑤16ku+LAM与16ku+38ku+LAM有近似相同的诊断价值。结论结核蛋白芯片对于检测肺结核和肺外结核有一定的辅助诊断价值。     

单纯疱疹病毒2型gG-2"独特区"基因的原核表达及其血清学诊断价值

目的在大肠杆菌中表达HSV-2的gG-2"独特区"基因(gG-2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV-2的gG-2T,并在大肠杆菌中表达gG-2T融合蛋白。通过Western blot和间接ELISA鉴定融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的gG-2T融合蛋白可以与GST多克隆抗体结合并在46 ku附近出现特异性结合条带。并且能够与确诊的HSV-2患者血清反应,而不与HSV-1患者血清和正常人血清反应。结论获得了HSV-2 gG-2T融合蛋白,它可以与GST多克隆抗体特异性结合并且可以同HSV-2型患者血清特异性反应;获得的gG-2T蛋白为研究以gG-2蛋白作为靶区域的诊断试剂盒和疫苗研发打下实验基础。     

纯化葎草花粉变应原免疫治疗的研究

目的　观察纯化草花粉变应原特异性免疫治疗 (SIT)的疗效。方法　采取凝胶过滤方法部分提纯草花粉变应原。将 86例季节性草花粉过敏性哮喘患者随机分为纯化草花粉变应原SIT观察组 (A组 )及粗制变应原SIT对照组 (B组 ) ,采取双盲法 ,为时半年。观察临床疗效、副反应 ,以及SIT前后的T淋巴细胞亚群、皮肤试验 (IT)风团直径、嗜碱性粒细胞脱颗粒试验 (HBDT)指数及特异性IgE (sIgE)指数均值。 结果　A组总有效率 90 .7%(39/ 4 3) ,B组 79.1% (34/ 4 3,P <0 .0 5 )。A组SIT后仅 1例出现轻度副反应。两组SIT后CD4细胞及CD4/CD8显著降低 ,CD8细胞显著升高 ,且A组变化更明显。两组SIT后ID风团直径、HBDT指数及sIgE指数均值都较SIT前明显下降 (P均 <0 .0 1) ;A组SIT后上述指标下降程度较B组更明显 (P均 <0 .0 1)。结论　纯化草花粉变应原SIT的疗效优于粗制变应原 ,副作用小。提示纯化草花粉变应原SIT后对变态反应抑制性强于粗制变应原。     

表皮生长因子受体Ⅲ型变异体（EGFRvⅢ）多克隆抗体的制备及特异性

为了制备针对EGFRvⅢ的特异性多克隆抗体,在实验中利用耦联了血蓝蛋白的EGFRvⅢ特异性的PEP3合成短肽进行动物免疫,制备抗血清;构建了pET30a／E33XI原核表达载体,表达和纯化了融合蛋白His-E33（EGFRvⅢ的部分胞外区）;以此融合蛋白作为抗原制备了抗体纯化柱,通过柱上纯化的方法从抗血清中提取针对EGFRvⅢ的特异性抗体．利用U87、U251、HeLa和HEK-293细胞进行免疫组化实验来检验抗体的特异性．