宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的　分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法　采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果　成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。结论　中国人宫颈癌HPV16E6基因结构有一定的变异     

真核表达人乳头瘤病毒16型L_1蛋白在检测宫颈癌患者相应抗体的应用

用真核表达HPV16L1蛋白为抗原，酶联免疫吸附测定64例宫颈癌患者血清和阴道分泌物的相应抗体，并用型特异性聚合酶键反应检测宫颈癌组织HPV16L1基因。结果：宫颈癌组血清HPV16L1抗体阳性年64．1％，对照组20．8％；宫颈癌组阴道分泌物HPV16L1抗体阳性率64.1％，对照组25％；宫颈癌组HPV16L1基因检出率为42．2％，对照组10％。有显著差异（P＜0．01）。结论：高危型HPV感染，宫颈癌患者有明显免疫反应，全身和局部无明显差异，真核表达HPV16L1蛋白可用于宫颈癌患者的抗体测定。     

子宫颈癌患者HPV16 E6,E7血清抗体检测

通过基因工程技术制备HPV16 E6,E7抗原,用免疫酶联吸附法检测了44例子宫颈癌病人和20例健康献血员血清HPV16 E6,E7抗体。结果表明,健康人血清HPV16 E6和HPV16 E7抗体阳性者分别占35％(7/20)和20％(4/20)。病人血清中,HPV16 E6抗体阳性率68.18％(30/44),但其反应滴度均值与健康人无显著差异。HPV16 E7抗体阳性率为58.18％(25/44),其阳性率及反应滴度均明显高于健康人。这提示,HPV16 E6抗体可能并非HPV16的型特异性抗体,而HPV16 E7抗体则有可能成为子宫颈癌发生的预报信号。     

应用PCR方法检测人乳头瘤病毒的E_7转化基因

应用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）检测５４份子宫颈癌活检标本中人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ７转化基因的存在情况，结果显示阳性率为７２．２％（３９／５４）。ＨＰＶ－１６Ｅ７转化基因在人子宫颈癌组织中的高检出率，证实该转化基因与其发生关系密切。本研究同时证明，ＰＣＲ方法具有敏感、特异、快速和实用特点，值得推广。     

维吾尔族妇女宫颈癌组织中p16蛋白与HPV16/18的相关性

目的探讨在维吾尔族妇女宫颈癌组织中p16蛋白的表达和HPV(16/18型)感染的关系。方法采用免疫组化S-P法和聚合酶链反应(PCR)技术检测34例正常宫颈组织(汉族19例,维吾尔族15例)以及40例宫颈癌组织(汉族18例,维吾尔族22例)中p16蛋白的表达和HPV16/18的感染情况。结果维吾尔族宫颈癌及正常宫颈组织中p16蛋白的阳性表达率与汉族相比均无统计学差异(P>0.05);维吾尔族、汉族宫颈癌中p16蛋白的阳性表达率(97.50%)明显高于维吾尔族、汉族正常宫颈组织(2.94%)(P<0.05)。HPV16型感染的宫颈癌中维吾尔族阳性表达率(54.54%)高于汉族(22.22%)(P<0.05);但HPV18型感染的宫颈癌无统计学意义(P>0.05)。维、汉宫颈癌组织中p16蛋白表达量与HPV16型感染的相对表达量呈显著正相关性(r=0.603,P<0.05)。结论p16蛋白和HPV联合检测可能作为检查宫颈癌的标记物,提高宫颈癌的检出率。     

应用PCR技术克隆人乳头瘤病毒16型E6基因

为进一步研究与宫颈癌发生密切相关的人乳头瘤病毒16型E6基因的转化作用,我们运用PCR技术扩增HPV16 E6 DNA,以pUC—19为载体,大肠杆菌了JM103为宿主菌,组建了质粒pRCE6经限制性核酸内切酶和Southern转印杂交证实,其插入片段约为0.5Kb,含有全部HPV16 E6序列。该质粒的组建为检测HPV感染中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针。同时为进一步研究HPV16 E6基因的转化作用及转化蛋白打下基础。     

THE DETECTION OF HPV16E6，E7 GENES IN TISSUES AND THEIR ANTIBODIES IN THE SERA OF PATIENTS WITH CERVICAL CARCINOMA

ＴＨＥＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＨＰＶ１６Ｅ６，Ｅ７ＧＥＮＥＳＩＮＴＩＳＳＵＥＳ　ＡＮＤＴＨＥＩＲ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＩＮＴＨＥＳＥＲＡＯＦＰＡＴＩＥＮＴＳＷＩＴＨ　ＣＥＲＶＩＣＡＬＣＡＲＣＩＮＯＭＡＬｉｕＴｉａｎｊｕ；ＬｉｕＨｕａ；，ＳｕｎＹｉ；，Ｓ...     

TDI-FP法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16、18型别感染

目的通过模板介导的染料终止子掺入-荧光偏振技术(TDI-FP)检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16、18感染情况,以初步探讨本地区HPV流行特点。方法基于TDI-FP的基本原理,以HPV16、18 L1克隆重组质粒为模板,用HPV通用引物GP5+/6+PCR扩增,再通过检测探针杂交后掺入的特异荧光素标记碱基的不同来判断病毒的类型。结果在宫颈癌组织中HPV16和18型阳性率分别为61.8%及32.7%,高危型HPV占宫颈癌HPV的98.1%,宫颈癌组高危型HPV阳性率显著高于癌前病变组和慢性宫颈炎组。结论初步提示宫颈癌患者HPV感染以高危型为主,其中有超过一半的患者以HPV16型感染为主。TDI-FP是一新兴的高通量基因检测技术,快速、可靠、敏感、特异并且操作简便,更适合于大规模临床筛查及在临床上广泛推广应用。     

人子宫颈癌中的HPV_(16)E_6mRNA、p~(53)、P~(21)~(ras)和c-myc蛋白表达

为进一步探讨子宫颈癌的分子发病机制，采用PCR、ISH和IHC方法对51例子宫颈癌组织的HPV16感染、HPV16E6mRNA、p53、p21ras和c－myc蛋白表达分布进行了研究。结果表明51例中有HPV16感染者38例，HPV16E6mRNA表达者35例，其阳性细胞主要分布在高分化癌巢之周边部或中、低分化癌之整个癌巢；p53、p21ras和c－myc蛋白阳性检出率分别为33．3％、60．8％和76．5％，其阳性细胞是弥漫或灶状分布。统计分析表明HPV16感染与P53、P21ras、c－myc蛋白积累间无关，但后三者间则显著相关。这提示癌基因活化或抗癌基因的失活及HPV16感染等因素之协同在子宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

DIG－DNA探针检测宫颈癌组织中HPV－16的E_7转化基因

应用地高辛配基（Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ）标记人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ７转化基因作探针，分别检测了宫颈癌活检组织、宫颈炎及正常宫颈脱落细胞ＤＮＡ。其检出率为：宫颈癌中４２．１％（２４／５７）、宫颈炎中２．５％（１／３９）、正常宫颈中５．５％（１／１８）。宫颈组织中ＨＰＶ－１６Ｅ７转化基因的检出率较高，提示该转化基因与宫颈癌的发生可能密切相关。本研究也证实ＤＩＧ配基标记的Ｅ７基因探针具有特异、敏感、安全、稳定和能反复使用的优点，适合基层使用。     

女性外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的相关性

目的研究外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的关系。方法收集西安交通大学医学院第二附属医院手术治疗的44例女性外阴病变患者的临床病理资料,包括鳞癌11例,鳞状上皮内瘤变(VIN)10例,尖锐湿疣9例及白色病变14例。采用免疫组化SP方法检测HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白的表达。结果①4组外阴病变患者年龄中位数依次为:外阴鳞癌61岁、VIN 45.5岁、尖锐湿疣24岁、外阴白色病44岁,尖锐湿疣组中位年龄低于外阴鳞癌组及白色病变组(P<0.05),其余各组间中位年龄无统计学差异。②HPV16/18E6蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组及外阴鳞癌组的阳性率分别为2/14、3/9、3/10、8/11,外阴鳞癌组高于白色病变组(P<0.05),其余各组间无统计学差异;HPV6L1蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组、外阴鳞癌组的阳性率分别为1/14、8/9、4/10、3/11,尖锐湿疣组高于其他各外阴病变组(P<0.05),其余各组间比较差异无统计学意义。③HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白在早期外阴鳞癌的阳性率均高于中晚期(P<0.05);HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白表达均与外阴鳞癌的组织学分级、年龄分组、绝经情况、产次不相关(P>0.05);HPV16/18E6蛋白与HPV6L1蛋白在外阴鳞癌中的表达不相关(P>0.05)。结论外阴病变的发病与年龄及HPV16/18、HPV6感染有关;外阴鳞癌中HPV16/18、HPV6的感染率与FIGO分期有关,HPV16/18感染率与HPV6的感染率无关。     

用分子杂交法探讨HSV、HPV与宫颈癌的相关性

宫颈癌的流行病学特点提示癌的发生与感染因素有关。主要涉及两组病毒:单纯疱疹病毒(HSV)和人乳头瘤病毒(HPV)。为了探讨HSV、HPV 与宫颈癌的关系,我们以~(32)P 标记HSV—2DNA 和HPV DNA,分别用Southern 转印和打点杂交技术,同时检测了73例宫颈癌和14例正常宫颈活检标本。在严格状态下杂交,65例宫颈癌中未发现HSV—2DNA,其中19例癌组织RNA 与HSV—2DNA 杂交阳性。研究发现与宫颈癌组织RNA 杂交阳性的HSV—2DNA 位于0.2～0.33,0.58～0.625图谱单位。此外,在25例宫颈癌中检出了HPV_(16) DNA,2例标本检出了HPV_(18) DNA。在非严格状态下杂交,8例经PstⅠ酶切的宫颈癌组织DNA,Southern 转印后分别与HPV_(16) DNA 和HSV—2BglⅡ克隆片段杂交。结果,6例检出了HPV_(16)DNA,1例既检出了HPV_(16)DNA,又检出了HSV—2DNA。初步结果说明HPV、HSV—2与宫颈癌的发生可能有关。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

用PCR-SSCP方法研究子宫颈癌组织中人乳头瘤病毒E_7基因的变异

运用核酸杂交和聚合酶链式反应（ＰＣＲ）对临床确诊的６１份子宫颈癌Ⅱ～Ⅲ期标本进行了人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ７基因的检测。非同位素地高辛标记探针斑点杂交阳性检出率为４５．９％，ＰＣＲ检测阳性率为５４．１％，两种检测结果证实ＨＰＶ－１６型感染与子宫颈癌的发生密切相关。进一步用灵敏的单链构象多态性分析法（ＳＳＣＰ）对３３例阳性标本进行分析，发现有２７例单链ＤＮＡ迁移率与正常对照有不同，推测均发生了ＤＮＡ序列的改变，提示ＨＰＶ－１６Ｅ７基因的变异在子宫颈癌组织中是较常见的现象，其与子宫颈癌的发生有一定的关系。     

人乳头瘤病毒16型转化基因的筛选及次级克隆

人乳头瘤病毒16型转化作用在宫颈癌发生中可能起重要作用,其转化基因主要位于基因组早期区域E6、E7开放阅读框架内。为了进一步研究HPV16转化作用,我们以Pstl+ECoRI酶解HPV16DNA,以pUC-19为载体,大肠杆菌JM103细胞为宿主菌,经两次定向次级克隆,组建了质粒pEP-8。经限制性核酸內切酶和Southem转印杂交证实,其插入片段为-1.43Kb带有E6、E7 ORF的DNA片段。在E6区上游序列还含有两个TATA盒,1个Cat盒和1个细胞特异性增强子。该质粒的组建为检测HPV感染细胞中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针,同时为进一步研究HPV转化作用及转化蛋白打下了基础。     

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的　为构建人乳头瘤病毒 1 1型 (HPV1 1 )DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法　利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA ,采用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因克隆。结果　从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 1 1型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体T easy中构建重组质粒 ,转化JM1 0 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。结论　该实验的成功为下一步制备HPV1 1的治疗性疫苗奠定基础。     

CLONING OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16 GENOME FROM CERVICAL CANCER TISSUE

Humanpapillomavirus(HPV)caninducemanybenignproliferateddiseases,forexample,lowergenitalwartsandhasacloserelationshipwithcervicalcancer.Morethan70typesofHPVhavebeenclonedandidentifiedc1J.MostofthemwereclonedintoplasmidPBR322.SinceHPVcannotproliferateinanycellcultureinvitroasyetmostHPVDNAsusedinChinacomefromabroad.InordertoconstructourHPVDNAclone,theHPV-16DNAwasisolatedfromthecervicalcancertissueandclonedasfollows.MATERIALSANDMETHODS1SpecimencollectionandtissueDNAextraction…     

用聚合酶链反应检测口腔癌组织中人乳头状瘤病毒的E_6转化基因

作者采用聚合酶链反应（ＰＣＲ），并对照核酸斑点杂交法对１０例口腔恶性肿瘤组织中ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因进行了检测。这些肿瘤包括６例口腔粘膜鳞癌（ＳＣＣ），２例涎腺腺样囊性癌（ＡＣＣ），１例涎腺恶性多形性腺瘤（ＭＰＡ）和１例腭部软组织胚胎性横纹肌肉瘤（ＥＲ）。对照组为１０例非肿瘤组织，包括唇裂、腭裂粘膜组织标本各５例。结果表明两种方法检测结果基本一致，肿瘤组阳性６例（６／１０），包括４例ＳＳＣ，１例ＡＣＣ和１例ＥＲ（除外１例ＡＣＣ用核酸杂交法检测为弱阳性），其余为阴性；对照组用核酸杂交法检测４例，除１例唇裂标本为弱阳性以外，均为阴性（０／４）；用ＰＣＲ法检测１０例均为阴性结果（０／１０）。两组间ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因的检出率有明显差异（Ｐ＜０．０５）。这一结果为开展口腔癌的ＨＰＶ病因学研究提供了参考资料。     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7蛋白在NIH/3T3细胞中的表达和定位

目的　将带有人乳头瘤病毒 1 6型 (湖北株 )E7基因的真核表达载体 pL(E7 HB)SN导入NIH/3T3细胞进行瞬时表达。方法　重组质粒转染 3T3细胞通过DNA 磷酸钙共沉淀法 ;E7基因表达的检测采用RT PCR和间接免疫荧光实验。结果　E7基因导入真核细胞后能有效转录并表达E7蛋白 ,通过免疫荧光染色可看到E7蛋白主要定位在胞浆中 ,细胞核中也有 ,但量较少。结论　这可能和湖北株HPV1 6E7基因发生突变有关。