胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组图谱的构建及其差异分析

目的初步建立并优化用于脊髓组织蛋白质组分析的双向电泳技术。应用双向电泳技术建立胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组图谱,并对两者的差异进行比较,从整体水平上探究成鼠脊髓丧失再生能力的蛋白质基础。方法以大鼠脊髓为研究对象,应用以固相pH梯度等电聚焦为第一向、均一水平十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向的双向电泳体系,对样品制备、电泳参数、染色等技术环节中影响双向电泳分辨率的关键因素进行一系列的优化。采用ImageMaster 2D Elite图像分析软件对获得的胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组2-DE图谱进行图像分析,比较两者在蛋白质组表达上的差异。结果在此优化的实验条件下,获得了质量较好的脊髓组织蛋白质组双向电泳图谱。胎鼠脊髓蛋白质组图谱经图像分析后,可检测到838个蛋白点,成鼠脊髓蛋白质组图谱可检测到847个蛋白点。对胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组匹配差示图谱的分析发现,两者间存在813个差示蛋白。结论通过对各种条件的优化,初步建立了脊髓组织2-DE技术。对胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组的比较发现,两者存在明显差异。胎鼠与成鼠脊髓蛋白质组差示图谱的建立,为进一步筛选、鉴定与脊髓再生能力丧失有关的蛋白,并探究其作用机制打下了基础。     

胎儿生长受限子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱比较

目的 比较胎儿生长受限(FGR)子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱的差异,探索蛋白质组学技术在FGR引起子代神经系统发育异常的研究中应用的可能性.方法 建立SD大鼠的FGR模型,分离子代大鼠海马组织并提取总蛋白;进行双向电泳,比较FGR子代大鼠与正常大鼠海马组织的蛋白质表达差异.结果 FGR子代大鼠与正常大鼠海马组织双向电泳图谱分别检出647和626个蛋白点,对2张电泳图进行匹配后发现有18个蛋白点仅在FGR子代大鼠海马蛋白双向电泳图谱中表达,28个蛋白在2组大鼠海马组织中含量发生了3倍以上的变化,其中FGR组上调25个,下调3个.结论 初步建立了FGR动物模型比较蛋白质组学的技术方法;FGR子代大鼠海马蛋白质组与正常大鼠存在明显差异,差异点的发现为深入研究FGR引起子代高级神经活动异常的发病机制提供了有益的线索.     

丙型肝炎患者血清蛋白质组差异表达的初步研究

目的观察丙型肝炎病毒(HCV)患者血清蛋白质组的变化情况,为研究丙型肝炎的发病机制及治疗提供新的线索。方法收集丙型肝炎患者和健康对照者血清,去除血清中高丰度蛋白;应用双向凝胶电泳技术构建2组研究对象血清二维电泳图谱,Image Master软件分析所得图谱,寻找差异蛋白质点;基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对2组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果获得了HCV患者血清蛋白质双向电泳图谱,对表达差异2倍以上进行质谱鉴定,共鉴定出15种蛋白质。结论成功鉴定了15个HCV相关蛋白质,为进一步研究其发病机制及治疗手段提供了实验基础。     

适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组分析的双向电泳技术

目的建立适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组的双向电泳分离条件。方法冷冻干燥法制备囊液总蛋白提取物,观察不同的蛋白样品处理方法、IPG胶条pH范围和电泳上样量对双向电泳图谱的影响。结果经ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit处理的提取物上样量为400μg,在pH7~10范围的胶条进行双向电泳分离,可获取蛋白斑点较多、重复性较好的二维电泳图谱。结论建立的细粒棘球蚴囊液双向电泳技术及图谱,可为细粒棘球蚴虫蛋白质组学的研究提供理论依据。     

NLCM纯化的不同分化程度贲门腺癌细胞差异蛋白质组学研究

目的联合导向激光捕获显微切割技术(NLCM)及蛋白质组学技术比较分析高分化贲门腺癌细胞和低分化贲门腺癌细胞的蛋白质表达图谱差异,寻找与贲门腺癌恶性程度和预后有关的分子标志物。方法应用导向激光捕获显微切割技术分别获取高分化和低分化贲门腺癌细胞,提取蛋白质,应用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离蛋白质,选定差异点,胶内酶解后,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)鉴定差异蛋白质,并用免疫组化方法验证差异蛋白的表达。结果 1NLCM分别分离纯化了高分化和低分化贲门腺癌细胞;2建立了高分化和低分化贲门腺癌细胞的蛋白质表达图谱,两组分别检测到(846±52)个和(923±84)个蛋白质点,两组的匹配率为85.4%;3对高分化和低分化的贲门腺癌蛋白质表达谱进行比较分析,鉴定出10种差异蛋白,其中6个蛋白质在低分化贲门腺癌细胞中表达上调,4个蛋白质在低分化贲门腺癌细胞中表达下调;4差异蛋白质涉及细胞间信号转导、细胞代谢、凋亡及迁移等;5进一步通过免疫组化方法验证了差异蛋白HSP27的表达与蛋白质组学研究结果一致。结论高分化和低分化贲门腺癌间存在蛋白质表达的差异,这些差异表达的蛋白质可能与贲门腺癌的恶性程度和预后有关。     

三羟基异黄酮抑制乳腺癌细胞生长的质谱研究

目的 初步研究低浓度的三羟异黄酮对人乳腺癌细胞系MCF-7的生长抑制作用,并通过蛋白质组学方法探讨其分子机制.方法 MCF-7细胞在含25μmol/L三羟异黄酮的培养液中分别培养1～7d后,进行MTT实验,测得生长曲线;采用顺序抽提的方法将细胞总蛋白分级为水溶性和疏水性两个组分,并应用双向电泳方法对其进行分离,以获取蛋白质的表达谱;通过软件分析,找出表达量存在显著差异的蛋白质点;再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)与生物信息学相结合的方法对差异表达蛋白点进行分析鉴定.结果 25μmol/L的三羟异黄酮对MCF-7细胞具有明显的抑制作用,并在4d后观察到细胞凋亡现象的出现;双向电泳图谱分析表明无论是水溶性蛋白质还是疏水性蛋白都取得了很好的分离,并成功鉴定出24种差异表达蛋白,其中5种下调,19种上调.结论 这些蛋白质的功能涉及了细胞的生长调节、应激反应、形态和凋亡等多个方面.     

导向激光捕获显微切割技术在贲门腺癌差异蛋白质组学的应用研究

目的建立一套适用于贲门腺癌差异蛋白质组学研究的导向激光捕获显微切割技术(navigated laser capture microdissection,NLCM)方法,并探讨其可行性。方法比较染色剂和固定剂对蛋白质影响的差异,探讨不同处理条件下贲门腺癌和癌旁组织切片的镜下组织学特点,改进常规LCM,建立在染色切片指引下分离细胞的NLCM技术,并通过双向凝胶电泳分析对该技术进行评价。结果染色剂对蛋白质的影响大于700mL/L乙醇固定剂;光镜下在不染色的组织切片上,贲门腺癌细胞、肠化生细胞和正常柱状上皮细胞都有其各自的形态特异性,易于辨认;NLCM可以准确纯化贲门腺癌细胞、肠化生细胞和正常柱状细胞;LCM的苏木素染色贲门腺癌细胞(A组)、NLCM的无染色贲门腺癌细胞(B组)和未切割的新鲜贲门腺癌组织(C组)的双向电泳表达图谱非常相似。各组蛋白质点的数量之间差异无统计学意义(P>0.05)。A组碱性端蛋白等点聚焦较差,部分蛋白质点的表达量减低或消失,B组双向电泳表达图谱蛋白质点分离较好。结论 NLCM不但可以快速、准确地将贲门腺癌及其癌前病变细胞进行分离,而且有效避免了染色剂对蛋白质提取质量的影响,是一项适用于贲门腺癌蛋白质组学研究的样品制备方法。     

蛋白组学分析放射抗拒性鼻咽癌细胞差异表达蛋白

目的筛选同一来源放射敏感性不同的鼻咽癌细胞蛋白组学差异表达,探讨鼻咽癌放射抗拒机制。方法建立放射敏感性不同的人鼻咽癌细胞株,采用双向凝胶电泳技术和图像分析软件PDQuest分离和分析不同阶段细胞间的差异蛋白质点,采用LC-MS/MS质谱分析系统鉴定差异蛋白质点,采用Gene Oncology Annotation将已知差异蛋白质进行分类。部分筛选蛋白质采用Western blot进行验证。结果 CNE-2和CNE-2R细胞有差异候选差异蛋白质27个,其中11个蛋白质在放射抗拒CNE-2R细胞中表达下调,16个上调。其中的4个:4-3-3σ、GADD45、PRKDC和HSP27用Western blot的方法得到了进一步确认。结论 CNE-2细胞受射线反复照射产生放射抗拒性细胞,在蛋白组学水平上发生了某些突变,并将这些突变稳定的遗传下来,从而表现出放射抗拒性的表型;通过调控其中与放射抗拒性产生相关的某些蛋白表达,就有可能调控细胞的放射敏感。4-3-3σ、GADD45、PRKDC和HSP27是预测NPC放疗敏感性的潜在基因标志物,它们表达失调可能参与NPC放射抗拒性的产生。     

肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究

目的 探讨肿瘤间质灌注液蛋白质组作为分析肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组的可能性.方法 应用PBS液孵育新鲜肿瘤组织,提取肿瘤间质灌注液中的总蛋白,并应用蛋白质组学技术对其进行分析研究.结果 应用双向电泳、质谱和生物信息技术成功分离并鉴定出肿瘤间质灌注液中的蛋白成分;在肿瘤间质灌注液中发现肿瘤分泌蛋白Profilin-1.结论 肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究为研究肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组提供了新的研究方案.     

应用基因芯片技术筛选克山病差异表达基因

目的应用基因芯片技术筛选克山病(Keshan disease,KD)患者和正常对照者外周血差异表达基因并对其进行分析,探讨KD发病的分子机制。方法收集16例KD患者和16例病区健康对照外周血样品,提取总RNA,纯化后合成cRNA探针;采用Agilent全基因组表达芯片检测基因表达的差异,以SAM4.0软件,结合IPA软件比较KD患者和正常对照个体外周血中的基因表达谱差异、功能及通路分析。结果与对照组相比,KD患者血样中差异表达基因上调的有59个,下调的有19个,基因功能主要涉及代谢、转录、离子通道与运输蛋白、蛋白质的合成与修饰、信号转导等;生物功能主要涉及细胞凋亡、细胞功能修复、分子转运、细胞增殖和分化、细胞间信号转导等。网络蛋白介导的内吞作用是差异最显著的通路。结论 KD患者外周血单核淋巴细胞多个差异表达基因显著不同于正常人,主要涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞功能修复等,这些基因可能在克山病发生发展中发挥重要的作用。