芳香硫酸酯酶定点饱和突变方案的比较

目的比较随机引物与精确引物PCR扩增实施绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase, PAAS)定点饱和突变的整体效率及成本,以建立高效实用的定点饱和突变方案。方法以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase, ECAP)与PAAS融合表达质粒为模板,分别用针对PAAS目的位点的随机引物、精确引物等量混合物及单个精确引物,进行全质粒PCR扩增构建定点饱和突变体库;碱裂解细胞后高通量测定PAAS突变体与ECAP活性比值进行筛选,比较3种定点饱和突变建库方案需筛选的单克隆数量、所获突变体种类、整体耗时、整体成本及影响因素。结果用随机引物PCR对M72位定点饱和突变有明显密码子偏好性,筛选超600个单克隆仅获得10种预期突变体,但对G138位定点饱和突变未见明显的密码子偏好性且筛选不到150个单克隆获得18种预期突变体;精确引物等量混合物对M72位实施定点饱和突变,筛选不超过190个克隆成功获得19种预期突变体;单个精确引物对M72位逐个PCR实施定点饱和突变,仅各筛选2个单克隆就获得19种预期突变体。单个精确引物逐个PCR实施定点突变所获饱和突变体库完整,需筛选的单克隆数最少,总耗时和总成本最低;相比之下,用随机引物和精确引物等量混合物实施定点饱和突变时,所需筛选的单克隆数、整体耗时及成本均显著增加。结论解析序列-活性关系时,用单个精确引物逐个PCR实施定点饱和突变有显著整体成本和效率优势;仅筛选阳性突变体时,用精确引物等量混合物进行PCR建库在成本和效率上更有优势。     

分析谷胱甘肽-S-转硫酶的产物抑制反应过程测定还原型谷胱甘肽

目的以谷胱甘肽-S-转硫酶(GST)为模型,探讨有产物抑制时用积分法分析酶反应过程测定底物量的可靠性。方法从猪肝制备GST。1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)终浓度为1.0 mmol/L,监测GST催化还原型谷胱甘肽(GSH)与CDNB结合产物在340 nm吸收变化。用积分法预测反应终点的产物吸收。结果优化产物抑制常数可使此积分法所得反应终点产物吸收对剩余底物变化不敏感。此积分法测定GSH对常见干扰有抗性。此法测定大鼠肝匀浆中外加GSH回收率大于98%,线性响应上限接近90μmol/L,下限接近2.0μmol/L,所得大鼠肝GSH含量与文献报道一致。结论有产物抑制时用积分法也可定量底物;用此积分法进行动力学酶法分析具有一定普遍性,而且有明显优势。     

蓝藻对苦草生理指标的影响

为了探讨湖泊富营养化过程中沉水植物产生的生理反应,选择苦草为研究对象,通过室内模拟试验,研究了不同浓度蓝藻(在0,122,166μg/L和222μg/L)对其叶片和根部造成的生理影响。结果表明:苦草叶片可溶性蛋白含量随着蓝藻浓度升高而减少,同样苦草根部的根系过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)比活性受到不同程度的抑制。苦草叶片中的SOD比活性在第20 d显著高于10 d,而POD,CAT酶的比活性随着蓝藻浓度增加而增加,以适应氧化胁迫。丙二醛(MDA)在水中叶绿素a浓度为222μg/L时显著增加,苦草在蓝藻叶绿素a浓度122μg/L时,苦草通过调节其抗氧化防御系统去除过量活性氧,以适应蓝藻浓度引起的氧化胁迫。这为控制太湖中的蓝藻浓度和恢复苦草的生物种群提供了科学的理论依据。     

~(125)Ⅰ—联结法标记人超氧化物歧化酶

~(125)I-人超氧化物歧化酶是采用联结法进行标记,先标记羟苯丙酸酯,(Bolton Hunter Reagent),再将~(125)I-B.H.R 与SOD 相联。~(125)I-B.H.R 标记率为95%,放射性比度可达0.376 mci/μg,稳定性在两个月以上。~(125)I-SOD 联结标记率为50%,放射性比度为3.04μci/μg,用醋酸纤维膜和聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行放射性层析扫描,放化纯在95%以上,标记不影响该酶的生物活性和免疫活性,冷冻干燥,-20℃保存两个月不失去免疫活性,放化纯仍在95%以上。     

人超氧化物歧化酶的研制

从新鲜人红细胞中提取的超氧化物歧化酶(SOD)是用DEAE-纤维素和Sephadex G_(75)两次柱层析纯化,同时用测定抑制率来监测SOD的活性峰。纯化后的SOD紫外吸收光谱的最大吸收峰在270～275 nm范围内,聚丙稀酰胺凝胶圆盘电泳得到3个蛋白带,与NBT还原反应得到的活性带位置一致,分子量分别为41 687、31 623、15 136。生物活性为3300 umits/mg蛋白,每克分子SOD含Cu、Zn均为2克分子。     

乌头碱在家兔检材中的降解动力学

用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)分离测定生物性样品中的乌头碱。对乌头碱在离体生物检材中的降解动力学进行了研究。乌头碱在经不同处理的生物检材(凝血块、肝脏)中以表观二级动力学过程被降解,其降解速率常数K以4%甲醛溶液固定组中为最大(1.5619,0.7728μg/d),其次为95%酒精固定组(0.4891,0.7556μg/d),4℃冰箱放置组中最小(0.06372,0.0393μg/d),亦即中毒检材中乌头碱在冰箱中分解较慢,其次为在酒精固定剂中。从死亡或中毒后一段时间取检材检测,可用建立的动力学方程推算体內乌头碱是否已达中毒量或致死量。     

髓过氧化物酶对急性冠状动脉综合征患者的早期临床筛查价值

目的探讨髓过氧化物酶(MPO)对急性冠状动脉综合征(ACS)患者的早期临床筛查价值。方法将78例胸痛患者按ACC/AHA标准确诊ACS 41例、稳定性心绞痛(SAP)17例,其余20例为对照组。采用酶联免疫吸附法测定血浆MPO水平。结果 ACS组MPO水平明显高于对照组和SAP组(P<0.05);SAP组MPO水平高于对照组(P<0.05);MPO≥212.59μg/L组MPO、高敏感C反应蛋白(hs-CRP)、中性粒细胞(neutrophils)及ACS患者例数明显高于MPO<212.59μg/L组(P<0.05);MPO水平与neutrophils、肌酸激酶同工酶及ACS疾病严重程度呈正相关,与年龄、hs-CRP、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三脂、天冬氨酸氨基转移酶、空腹血糖、乳酸脱氢酶、红细胞计数、血小板计数无相关性;绘制ROC曲线(A=0.927,P<0.001),MPO诊断界值为212.59μg/L,MPO诊断ACS的灵敏度为95.1%,特异度为86.5%。本法与临床诊断ACS方法进行Kappa检验,P<0.001,Kappa系数值为0.819;采用Logistic逐步回归,MPO预测ACS总正确率为94.9%。结论 MPO是一种预测易损性斑块的炎症标志物,其能有效地早期筛查ACS患者。     

四味芳香开窍药的挥发性成分对缺血缺氧PC12细胞及细胞内Ca2+的影响

目的研究四味芳香开窍药的挥发性成分对连二亚硫酸钠(Na2S2O4)致PC12细胞缺血缺氧损伤及细胞内Ca2+的影响。方法体外实验采用5mmol/L的Na2S2O4导致PC12细胞缺血缺氧性损伤,然后观测细胞形态;用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)比色法,考察水蒸汽蒸馏法提取的麝香、苏合香、安息香挥发性成分及冰片对缺血缺氧PC12细胞活性的影响;并按照试剂盒要求测定模型细胞内Ca2+的含量。结果麝香4、8、16μg/mL,冰片8、16μg/mL,苏合香20、40μg/mL及安息香16μg/mL组均能显著升高模型细胞的吸光度(A)值(P<0.05,P<0.01),显著抑制Na2S2O4对PC12细胞的损伤;苏合香40、80μg/mL,安息香4、8、16μg/mL组均能显著降低模型细胞内Ca2+含量(P<0.05,P<0.01);麝香、冰片有降低模型细胞内Ca2+含量的趋势。结论麝香、苏合香、安息香的挥发性成分及冰片均有保护缺血缺氧PC12细胞的作用,其机制可能与降低细胞内Ca2+的含量,防止钙超载有关。     

改良骨骼肌肌纤维分型ATP酶染色方法

目的 采用经作者改良的Guth-Samaha肌球蛋白ATP酶染色方法,观察其对大鼠骨骼肌肌纤维分型染色效果.方法 取8μm厚度SD大鼠胸肌及肱二头肌冰冻切片,用含40g/L多聚甲醛固定液固定5min;Tris洗液漂洗后置预孵育液中室温下孵育15min;Tris洗液中漂洗2次,置孵育液中于37 ℃恒温水浴摇床中振摇孵育60min;10g/L氯化钙洗3次后置20 g/L氯化钴液中3min;蒸馏水冲洗,于10 g/L硫化铵液中孵育3min;自来水冲洗3min,常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,置显微镜下观察.结果 SD大鼠胸肌和肱二头肌经改良Guth-Samaha肌球蛋白ATP酶染色后均可清晰地显示出明亮色白的Ⅰ型纤维和幽暗深褐的Ⅱ型纤维.结论 改良Guth-Samaha肌球蛋白ATP酶染色方法具有试剂配制简单、操作简化和肌纤维分型效果满意等优点,值得在骨骼肌相关研究中借鉴应用.     

白花蛇舌草总黄酮对肝细胞癌干细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨白花蛇舌草总黄酮(FOD)对Huh7来源的肝细胞癌干细胞增殖及凋亡的影响。方法 培养Huh7细胞系,通过流式分选技术筛选出Huh7细胞系中CD133阳性的干细胞(CD133⁺-Huh7);流式分析术检测分选后CD133阳性细胞比例;Western blotting实验检测分选纯化前后细胞干性指标Nanog、Oct4、Sox2的表达。分别用0、50、100、400μg/mL FOD分别作用CD133⁺-Huh7肝细胞癌干细胞24、48、72、96 h,应用CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测其对细胞增殖的影响;平板克隆实验检测各组细胞增殖能力变化;Annexin V-PE/7-AAD法检测各组细胞凋亡比例,并用Western blotting法检测p53、FAS-FADD、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax及凋亡指标Cleaved-Caspae3等凋亡通路蛋白的表达。结果 纯化后的Huh7细胞的干性标志物Nanog、Oct4、Sox2表达更高。100μg/mL FOD刺激CD133⁺-Hu...