siRNA沉默EZH2基因对人宫颈癌细胞侵袭转移的影响

目的探讨靶向沉默EZH2基因对宫颈癌细胞侵袭转移的影响及其分子机制。方法采用化学合成siRNA瞬时转染人宫颈癌C33A细胞,沉默EZH2基因的表达。通过细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验、软琼脂克隆形成实验,观察沉默EZH2对宫颈癌细胞迁移、侵袭及体外成瘤能力的影响,Western blot法检测MMP2的表达变化。结果 EZH2siRNA转染C33A细胞后,细胞划痕及Transwell小室侵袭实验结果均显示宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力明显减低,差异具有统计学意义;软琼脂克隆形成实验表明,EZH2沉默后克隆形成数目明显减少,差异具有统计学意义;Western blot结果显示MMP2表达水平下调。结论沉默EZH2基因表达能显著抑制宫颈癌C33A细胞的侵袭转移能力,其作用机制可能通过下调MMP2来实现。     

miR-153-3p靶向TGFβ2对胶质瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的影响

目的探究miR-153-3p与转化生长因子β2(transforming growth factor-beta 2,TGFβ2)的靶向关系以及对体外培养胶质瘤细胞侵袭、迁移和上皮间质转化的影响。方法实时荧光定量PCR和Western blot检测miR-153-3p对SHG-44细胞TGFβ2mRNA和蛋白表达的影响;生物信息学软件预测miR-153-3p与TGFβ2的结合位点;荧光素酶报告实验分析miR-153-3p与TGFβ2的靶向关系;体外侵袭实验和划痕实验检测miR-153-3p对SHG-44细胞侵袭和迁移能力的影响;Western blot检测侵袭、迁移和上皮间质转化相关蛋白的表达。结果 miR-153-3p mimic抑制SHG-44细胞中TGFβ2mRNA和蛋白质的表达;软件预测显示miR-153-3p与TGFβ2存在连续的结合区域;miR-153-3p mimic与TGFβ2野生型报告载体共转后,细胞中荧光素酶的活性降低(P<0.01);miR-153-3p mimic与TGFβ2突变型报告载体共转后,细胞中荧光素酶的活性没有明显变化。miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后,侵袭细胞数目减少,划痕闭合率降低,基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP-2)、MMP-9、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达降低,神经钙黏蛋白(N-cadherin)、Snail-2、波形蛋白(Vimentin)和Twist的表达降低,上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的表达升高(P<0.01);TGFβ2高表达缓解miR-153-3p mimic对SHG-44细胞侵袭、上皮间质转化相关蛋白的表达。结论 miR-153-3p靶向TGFβ2抑制体外培养胶质瘤细胞侵袭、迁移和上皮间质转化。     

宫颈癌细胞系中EMT相关基因的表达及其意义

目的上皮-间质转化(EMT)是上皮来源的恶性肿瘤侵袭转移的重要机制之一,其特征为上皮细胞标志物表达下调(E-cadherin等)而间质细胞标志物(vimentin等)表达上调。本研究旨在探讨人宫颈癌细胞系EMT相关标志物的表达情况,以确定宫颈癌细胞是否发生EMT,并为确定相关的细胞研究模型奠定基础。方法采用逆转录PCR方法检测4株人宫颈癌细胞系(SiHa、HeLa、RJC-1、CS1213)中E-cadherin、vimentin、Snail和Slug mRNA的表达;Western blotting检测E-cadherin和vimentin的蛋白表达;免疫细胞化学方法检测Snail和Slug的蛋白表达。结果vimentin和Snail mRNA在4种细胞中均有表达,E-cadherin和Slug mRNA在SiHa、HeLa和RJC-1细胞表达。E-cadherin蛋白在SiHa和RJC-1细胞表达,vimentin蛋白在HeLa和CS1213细胞表达。Snail蛋白在4个细胞株都有表达,Slug蛋白在SiHa、HeLa和RJC-1细胞表达。结论 HeLa和CS1213表现出间质细胞表型,SiHa和RJC-1则表现为上皮细胞表型。     

chk2反义寡核苷酸对顺铂作用下HeLa细胞凋亡的影响

目的观察宫颈癌HeLa细胞转染chk2反义寡核苷酸后,在顺铂作用下对凋亡的影响。方法采用MTT法检测不同浓度顺铂作用人宫颈癌细胞株HeLa 24、487、2 h后对细胞的生长抑制率。以脂质体为载体将chk2正义链和反义链转染HeLa细胞,用Western blot检测HeLa细胞中Chk2蛋白的表达,用流式细胞仪和TUNEL法检测顺铂作用后细胞凋亡率。结果顺铂对HeLa细胞有生长抑制作用,并有时间和浓度依赖性;反义chk2转染后可明显抑制Chk2蛋白表达(P<0.01),顺铂作用下细胞凋亡率明显高于转染正义链组(P<0.01)。结论反义寡核苷酸封闭chk2基因可增加HeLa细胞对顺铂的凋亡敏感性。     

RNA结合蛋白La对宫颈癌细胞侵袭转移的影响及其机制

目的探讨RNA结合蛋白La(La)对宫颈癌细胞侵袭转移的作用及其作用机制。方法采用RNA干扰技术沉默La基因在宫颈癌细胞株HeLa中的表达,并通过G418筛选,构建稳定表达的HeLa的La干扰克隆。采用划痕实验、Transwell小室等检测La对宫颈癌细胞侵袭转移的影响。利用Western blot的方法检测细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的表达,并采用明胶酶谱的方法检测细胞培养上清中MMP-2的活性。结果 La干扰后细胞的迁徙和侵袭能力明显降低,对细胞迁徙距离和穿过Transwell小室的细胞数目进行分析后发现,差异有统计学意义;同时发现在细胞中MMP-2的蛋白表达水平及酶活性均降低,而TIMP-2的蛋白表达水平上调。结论 La对宫颈癌的侵袭转移具有促进作用,这种作用可能与其对基质金属蛋白及其抑制剂的调控相关。     

肿瘤抑制因子DACT2在神经胶质瘤细胞上皮间质转化中的作用机制

目的探讨肿瘤抑制因子β-连环蛋白抑制基因2(DACT2)对神经胶质瘤细胞上皮间质转化的影响及潜在机制。方法以神经胶质瘤细胞U87、U251、A172和SHG44为研究对象,5-Aza处理后RT-PCR检测细胞中DACT2基因表达,甲基化特异PCR法(MSP)检测细胞中DACT2启动子甲基化状态,Western blot检测细胞中DACT2蛋白表达;构建过表达DACT2的U87细胞株,并用Western blot进行验证。Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力,Western blot检测细胞中上皮间质标记物E-cadherin、Vimentin、MMP2及Wnt/β-cadherin通路蛋白active-β-cadherin、p-β-cadherin和totalβ-cadherin的表达变化。结果 5-Aza处理后4株细胞中均观察到DACT2基因表达,而未处理的U87和U251细胞中无DACT2基因表达,A172和SHG44细胞中DACT2有微弱表达。U87和U251细胞中DACT2启动子区完全甲基化,而A172和SHG44细胞中部分甲基化。U87和U251细胞中DACT2蛋白和mRNA表达低于A172和SHG44细胞(P<0.05)。转染pcDNA3.1-DACT2载体后,U87细胞中DACT2表达显著增加(P<0.05),过表达DACT2的U87细胞构建成功。过表达DACT2能抑制U87细胞上皮间质转化、侵袭迁移并阻断Wnt/β-catenin通路激活(P<0.05)。结论神经胶质瘤细胞中DACT2启动子呈高度甲基化状态,外源过表达DACT2能够促进胶质瘤细胞U87上皮间质转化和侵袭迁移,其机制可能与DACT2调控Wnt/β-catenin信号通路有关。     

miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及其靶基因的初步研究

目的探讨miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。方法将SiHa细胞分成3组,分别转染miR-1246mimics(模拟物)、miR-1246inhibitor(抑制物)、空白质粒,并测定转染效率。采用MTT法对比转染后SiHa细胞增殖能力的区别;Transwell小室、划痕实验对比转染后SiHa细胞侵袭、迁移能力的区别;Western blot对比转染后SiHa细胞表达THBS2(血小板反应蛋白2)的区别。构建THBS2的3UTR双荧光素酶质粒,与miR-1246共转染入SiHa细胞,检测荧光素酶的相对活性。结果转染miR-1246mimics的SiHa细胞,MTT试验显示其增殖能力较另外两组强;划痕实验显示细胞的迁移能力较另两组强;迁移、侵袭实验显示该组细胞穿膜数量较另外两组多(P<0.01);WB实验显示其THBS2蛋白低表达(灰度值6.28±10.22,与空白对照组相比P=0.013)。转染miR-1246inhibitor的SiHa细胞,MTT试验显示其生长速度较另外两组慢;划痕实验显示细胞的迁移能力较另两组弱;迁移、侵袭实验显示该组细胞穿膜数量较另外两组少(P<0.01);WB实验显示其THBS2蛋白表达稍高(灰度值12.90±19.81,与空白对照组相比P=0.037)。共转染miR-1246mimics和包含THBS2的3UTR端双萤光素酶质粒后,SiHa细胞荧光素酶表达降低。结论 miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭、迁移能力有促进作用,THBS2是其靶基因,降调靶蛋白THBS2的表达,可能是miR-1246促进宫颈癌发生发展的其中一个机制。     

人CAP1蛋白真核表达及细胞定位与功能

目的构建CAP1蛋白真核表达质粒并使之在细胞内得以表达,确定CAP1蛋白在细胞中的定位及其对细胞迁移的影响。方法以HeLa细胞cDNA为模板,经PCR获取CAP1编码区cDNA,将该编码区cDNA序列插入pCMV-Myc质粒中,构建带Myc标签的真核表达重组质粒。重组质粒转染至293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达;重组质粒转染HeLa细胞,免疫荧光法检测其细胞内的定位,划痕实验观察其对细胞迁移的影响。结果成功构建了CAP1真核表达重组质粒,并在真核细胞内成功表达,确定CAP1定位于细胞质中,划痕实验证明CAP1过表达的细胞迁移能力明显下降。结论在真核细胞中成功表达了CAP1重组质粒且CAP1定位于细胞质,其过表达对细胞迁移有抑制作用,为研究CAP1的生理功能奠定实验基础。     

Cystatin M抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖和迁移

目的 CST6基因编码cystatin M蛋白,体外构建CST6过表达载体,转染胃癌SGC-7901细胞株,观察cystatin M对其增殖和迁移能力的影响。方法实验分3组:pcDNA3.1(+)-CST6组、pcDNA3.1(+)组与未转染组;RTPCR验证稳转系SGC-7901/CST6细胞CST6RNA水平的表达;Western blot验证稳转系SGC-7901/CST6细胞CST6蛋白水平的表达;MTT实验检测实验组与对照组细胞的增殖能力;划痕实验检测实验组与对照组细胞的迁移能力。结果稳转系SGC-7901/CST6细胞稳定表达CST6基因mRNA和cystatin M蛋白;pcDNA3.1(+)-CST6组细胞增殖能力和迁移能力均较pcDNA3.1(+)组和未转染组细胞降低(P<0.05)。结论 Cystatin M能够抑制胃癌SGC-7901细胞株增殖和迁移能力。     

黄芩苷对宫颈癌HeLa细胞侵袭转移的抑制作用及其机制

目的观察黄芩苷对宫颈癌HeLa细胞侵袭转移的作用及其相应机制。方法利用MTT法检测黄芩苷对HeLa细胞增殖的影响;Transwell小室法检测黄芩苷对HeLa细胞侵袭能力的影响;Real-time PCR法检测黄芩苷对MMP-2、MMP-9RNA表达水平的影响;Western blot法检测黄芩苷对MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响;Western blot法检测黄芩苷对P38和p-P38蛋白表达的影响;Real-time PCR法检测黄芩苷和sb203580联合应用对MMP-2和MMP-9RNA表达水平的影响。结果黄芩苷能够有效抑制HeLa细胞的增值,当质量浓度超过60μg/mL时,与对照组相比(0μg/mL)差异出现统计学意义。在低于细胞增殖抑制浓度时,黄芩苷也能够有效抑制HeLa细胞的侵袭,10、20、40μg/mL组穿过基质胶到达小室底端的细胞数目分别为对照组的(97.58±17.78)%、(67.95±49.75)%和(32.35±20.41)%。黄芩苷能够有效抑制HeLa细胞中MMP-2和MMP-9的表达及有效抑制HeLa细胞中P38的磷酸化水平;P38信号通路抑制剂预处理,能够增强黄芩苷对MMP-2和MMP-9表达的抑制作用。结论黄芩苷能够有效抑制HeLa细胞的侵袭转移,这种作用可能与其通过调节P38信号通路的活性进一步调节MMP-2和MMP-9的表达有关。