Cav1.3 L-型钙通道K228E突变体的构建及功能研究

目的 通过构建Cav1.3基因K228E突变,观察K228E突变对L-型钙通道电生理特性及蛋白表达和转运的影响.确定钙通道α1亚基结构域ⅠS4段上N-端带正电荷的氨基酸对该通道电生理学特性的作用,从而为创建钙通道起搏器奠定基础.方法 ①一步法快速定点诱变构建Cav1.3基因K228E突变体的真核表达载体;②膜片钳观察突变钙通道电流,激光共聚焦技术观察突变钙通道蛋白在细胞内的表达和定位.结果 ①检测表达于HEK293细胞上的L-型钙电流:转染野生型Cav1.3质粒和相关亚基质粒,可检出L-型钙电流,其半激活电压V1/2=(-36.56±2.08)mV、半失活电压V1/2 =(-42.93±0.14)mV(5mmol Ba2+);而转染K228E-Cav1.3质粒和相关亚基质粒的HEK293T细胞上未检测到钙电流;②检测K228E突变通道蛋白在细胞内的表达和定位:转染野生型和突变型Cav1.3质粒及相关亚基质粒,48h后观察到野生型与突变型钙通道蛋白在细胞膜上都有表达.结论 Cav1.3基因K228E突变虽不影响L-型钙通道蛋白质的表达与转运,但却不表达钙通道电流,是一种功能丧失性突变.     

β_2受体阻滞剂诱导胰腺癌细胞G1/S期阻滞的实验研究

目的研究β_2受体阻滞剂ICI118,551诱导胰腺癌细胞G1/S期阻滞及其相关机制。方法应用β_2受体阻滞剂ICI118,551和β_1受体阻滞剂美托洛尔干预胰腺癌细胞,通过流式细胞仪检测细胞周期、Western blot技术检测β_2受体阻滞剂对细胞周期调节蛋白Cyclin D1和Cyclin E表达的影响,EMSA技术检测核转录因子NF-κB的活性,构建裸鼠肾包膜下移植瘤模型检测肿瘤增殖情况。结果 ICI118,551可显著诱导胰腺癌细胞G1/S期阻滞,并显著优于美托洛尔组(P<0.05);ICI118,551干预组抑制Cyclin D1和Cyclin E的表达,并可抑制NF-κB的活性;裸鼠肾包膜下移植瘤实验显示ICI118,551可显著抑制胰腺癌细胞的增殖。结论β_2受体阻滞剂ICI118,551可有效诱导胰腺癌细胞G1/S期阻滞,抑制胰腺癌细胞的增殖。     

补骨脂素对乳腺癌干细胞拓扑异构酶Ⅱα表达的影响

目的探讨补骨脂素对乳腺癌干细胞拓扑异构酶Ⅱα(topoisomerase,TopoⅡα)表达的影响。方法选用乳腺癌多药耐药细胞株(MCF-7/ADR)为模型,用免疫磁珠法筛选乳腺癌干细胞;运用光学显微镜观察乳腺癌干细胞生长状态;用CCK-8法检测补骨脂素对乳腺癌干细胞的毒性作用以及阿霉素和阿霉素与补骨脂素联合用药组对乳腺癌干细胞的IC50,计算逆转倍数;运用RT-PCR检测拓扑异构酶Ⅱα基因mRNA表达水平;运用Western blot法检测拓扑异构酶Ⅱα蛋白表达水平。结果在光学显微镜下,乳腺癌干细胞呈球形生长;补骨脂素对乳腺癌干细胞的IC10为(6.77±0.23)μg/mL,IC20为(10.36±0.21)μg/mL;阿霉素对乳腺癌干细胞的IC50为(90.03±3.56)μg/mL,阿霉素与补骨脂素联合用药对乳腺癌干细胞的IC50为(21.47±0.82)μg/mL,逆转倍数为4.19倍;补骨脂素处理后,拓扑异构酶Ⅱα基因mRNA表达水平均升高,与对照组相比,6μg/mL组升高1.9倍(P=0.008,差异有统计学意义),10μg/mL组升高2.7倍(P=0.000,差异有统计学意义);补骨脂素处理后,拓扑异构酶Ⅱα蛋白表达均升高,与对照组相比,6μg/mL组升高1.8倍(P=0.003,差异有统计学意义),10μg/mL组升高2.4倍(P=0.000,差异有统计学意义)。结论补骨脂素能够上调乳腺癌干细胞拓扑异构酶基因和蛋白的表达,增加药物的作用靶点,逆转乳腺癌干细胞对阿霉素的耐药。     

姜黄素对多巴胺诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的探讨姜黄素对多巴胺(dopamine,DA)氧化应激损伤PC12细胞(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株)的拮抗作用的分子机制。方法以DA损伤PC12细胞为氧化应激损伤的模型,依次分成空白对照组、姜黄素组(20μmol/L)、DA组(200μmol/L)及DA(20μmol/L)+姜黄素组(200μmol/L),细胞培养24h后,采用MTT法检测细胞的增殖状况,采用Western blotting检测Bcl-2、Cyt-c及Caspase-3等蛋白的表达水平。结果①姜黄素可使DA对PC12细胞的抑制率明显下降。②姜黄素抑制DA诱导的细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调。姜黄素本身能上调细胞内Bcl-2的蛋白表达水平。③姜黄素抑制DA诱导的细胞凋亡蛋白Cyt-c表达上调。④姜黄素抑制DA上调细胞内裂解型Caspase-3蛋白的表达,但姜黄素本身对裂解型Caspase-3的表达无影响。结论姜黄素对DA氧化应激损伤PC12细胞的拮抗作用是通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调及抑制Cyt-c及Caspase-3的上调来实现的。     

钙离子载体A23187对转化生长因子β1刺激的肝星状细胞增殖、周期及凋亡蛋白caspase-3表达的影响

目的研究钙离子载体A23187对转化生长因子β_1(TGF-β_1)刺激的肝星状细胞增殖、周期及凋亡蛋白caspase-3表达的影响。方法将液氮保存下的肝星状细胞株,于37℃、50mL/L CO_2孵箱中进行复苏传代培养,同步化后将细胞分为5组:空白组、TGF-β_1(5ng/mL)组、TGF-β_1+低、中、高剂量钙离子载体A23187组,即5ng/mL TGF-β_1刺激24h,再分别加入1、2、4μmol/L不同剂量钙离子载体A23187作用24h后,用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,蛋白免疫印记测定凋亡蛋白caspase-3表达。结果不同浓度钙离子载体A23187均能显著抑制细胞增殖(P<0.05),且随着剂量的增加,细胞的相对增殖率(RGR)降低,低、中、高剂量组分别为85.93%、61.71%、48.43%,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);不同处理组G1期细胞比例、S+G2期细胞比例差异均有统计学意义(P<0.05),钙离子载体A23187剂量越大,G1期细胞比例越高,S+G2期细胞比例越低(P<0.05)。随着钙离子A23187浓度的增加,细胞内caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论钙离子载体A23187可能通过阻滞大鼠肝星状细胞由G1期进入S期和G2期,抑制细胞增殖,同时上调凋亡蛋白caspase-3的表达。     

绿原酸对视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44的生长抑制作用

目的探讨绿原酸(CHA)对体外培养人视网膜母细胞瘤(Rb)细胞株HXO-RB44的作用及机制。方法应用CCK-8体外抑制实验,筛选CHA对体外培养传6代的人Rb细胞株HXO-RB44的最佳抑癌浓度。Western blot检测人Rb细胞株HXO-RB44中抑癌基因Rb1和P16及细胞周期蛋白(Cyclin D2)和细胞周期蛋白依赖激酶(CDK 4)的表达变化;ELISA检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果 CCK-8体外抑制实验结果显示,CHA对人Rb细胞株HXO-RB44的最佳抑癌浓度为80μmol/L。经80μmol/L CHA处理5d的HXO-RB44细胞株中,抑癌基因Rb1和P16均有少量表达,而在阳性对照组(HT1080细胞)和未处理的HXO-RB44细胞几乎没有表达。CHA处理5d的HXO-RB44细胞株的Cyclin D2和CDK4的表达明显低于阳性对照组(HT1080细胞)和未处理的HXO-RB44细胞(P<0.01)。CHA处理5d的HXO-RB44的培养基中LDH的含量为(226.75±42.74)U/L,明显低于正常培养的细胞培养基(425.84±31.67)U/L(P<0.01)。结论 80μmol/L CHA可能通过增加HXO-RB44抑癌基因的表达,降低细胞周期蛋白的表达及LDH水平,而抑制HXO-RB44细胞株的增殖。     

PTEN通过拮抗PI3K/Akt信号通路抑制神经干细胞增殖

目的探讨PTEN抑制神经干细胞增殖的作用,以阐明是否可以通过抑制PTEN蛋白表达来促进神经干细胞增殖。方法取新生24h昆明小鼠海马组织,分离培养原代神经干细胞,并采用免疫荧光检测鉴定;将所培养的传代神经干细胞随机分组:正常组、缺血模型组、低氧组(低氧+缺血模型组)、Lip2000组(低氧+缺血模型组+Lip2000空转染组)、PTEN转染组(低氧+缺血模型组+Ad5-PTEN转染组)、PTEN干扰组(低氧+缺血模型组+Lip2000+PTENsiRNA干扰组),检测0、6、24、36、48h不同时间点各组神经干细胞的增殖情况,同时检测PTEN转染后PTEN蛋白在各组神经干细胞的表达情况,以及对PI3K-Akt信号通路上标志性蛋白表达的影响。结果免疫荧光检测Nestin以鉴定神经干细胞球,在荧光显微镜下观察到绿色明亮且典型的细胞球,球内可见清晰结构。MTT测定发现低氧组、Lip2000组培养36h时神经干细胞出现明显增殖,与模型组、PTEN转染组及PTEN干扰组相比,差异有统计学意义(P<0.05),其中PTEN干扰组的细胞增殖又较模型组、PTEN转染组明显,差异亦有统计学意义(P<0.05);与正常组细胞比较,模型组与PTEN转染组的PTEN表达升高(P<0.05),且均较正常组降低(P<0.05),其中低氧组、Lip2000组与PTEN干扰组降低的趋势相当(P>0.05)。PTEN质粒转染后各组总的Akt和bad未出现明显变化,但是与正常组比较,模型组与PTEN转染组的PI3K、p-Akt、p-bad表达降低(P<0.05),其中PTEN转染组的变化较为明显。低氧组、Lip2000组与PTEN干扰组的PI3K、p-Akt、p-bad表达升高(P<0.05)。结论低氧有助于促进神经干细胞增殖,PTEN对PI3K/Akt的抑制作用可能是成体神经干细胞增殖受阻的关键因素。     

亚低温对脑外伤后细胞凋亡的影响

目的　探讨亚低温对脑外伤后细胞凋亡的影响和可能机制。方法　自由落体法制作大鼠脑外伤模型 ,TUNEL法检测细胞凋亡分布及程度 ,免疫组化法检测Bcl 2和Bax蛋白的表达。结果　细胞凋亡率及Bax蛋白表达率均以对照组最高 ,亚低温治疗组次之 ,而Bcl 2蛋白的表达以假手术组最高 ,亚低温治疗组次之 ,对照组最低。结论　亚低温(33± 0 .5 )℃对脑外伤后细胞凋亡虽具有减弱作用 ,但尚未能达到完全抑制的程度。亚低温对Bcl 2和Bax蛋白表达的影响可能是亚低温减弱脑外伤后细胞凋亡的机制之一     

姜黄素对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖及氧化应激的影响

目的观察姜黄素(curcumin,Cur)对血管紧张素Ⅱ(AngII)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及氧化应激的影响。方法原代培养大鼠VSMCs细胞,MTT法测定不同浓度Cur对AngⅡ诱导VSMCs增殖的影响。并分别设对照组、AngⅡ干预组、20μmol/L Cur组及AngⅡ联用不同浓度Cur(5、10、20μmol/L)组,实时定量PCR和Western blot测定各组细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、p47phox mRNA与蛋白的表达;亚硝酸盐含量重氮化反应吸光测定法(Greiss assay)测定细胞内一氧化氮(NO)的表达;DCFH-DA氧化法测定细胞内活性氧(ROS)含量;黄嘌呤氧化酶法检测各试验组细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活性;分光光度计检测谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)活性。采用p47phox特异性siRNA干扰VSMCs p47phox的表达,并深入探讨Cur抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖及氧化应激的机制。结果 MTT法观察到Cur在0~80μmol/L浓度范围内对细胞活力无显著影响;Cur(5、10、20μmol/L)可以有效抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖。同时,Cur可有效抑制AngⅡ诱导的NO、iNOS、p47phox、ROS的高表达并有效提高SOD和Gpx的活性,且具有浓度依赖性。采用p47phox特异性siRNA下调p47phox表达,AngⅡ诱导的VSMCs内ROS生成减少。结论 Cur具有抑制AngⅡ诱导VSMCs的增殖及氧化应激作用。这一作用与减少iNOS诱导的NO合成,下调p47phox的表达抑制ROS产生、提高SOD和Gpx的活性,进而抑制AngⅡ诱导的VSMCs内氧化应激反应有关。     

依曲替酸对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响

目的研究依曲替酸对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)mRNA表达的影响。方法0.1和1μmol/L伊曲替酸处理正常人KC 12 h后,用噻唑蓝比色法(MTT法)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测KC增殖和HB-EGF mRNA表达的改变。结果依曲替酸处理12 h后,可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HB-EGF mRNA的表达。0.1和1μmol/L伊曲替酸分别使KC增殖抑制10.2%和14.4%,使HB-EGF mRNA增加到正常对照组的3.2和7.1倍。与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论依曲替酸可剂量依赖上调HB-EGF mRNA的表达,其可能参与依曲替酸对KC增殖的抑制作用。