先天性长QT综合征相关人类HERG基因真核表达载体的构建及其功能表达

目的构建先天性长QT综合征相关HERG基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,建立稳定的细胞系,探讨基因的功能。方法原核克隆载体pGEM-HERG经限制性内切酶获得HERG cDNA,将HERG cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3中,用Lipofectamin2000转染试剂介导将pcDNA3-HERG及荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染至HEK-293细胞,利用G-418进行细胞筛选,并用稀释法建立稳定的HEK-HERG细胞系。用全细胞膜片钳技术检测HERG基因的功能表达情况。结果在原核克隆载体pGEM-HERG的基础上构建了HERG的真核表达载体pcDNA3-HERG,并使其在HEK-293细胞中成功表达,建立的HEK-HERG细胞系稳定传代。膜片钳技术检测到了HERG通道电流的表达。结论该方法可成功构建及表达HERG的真核表达载体,为今后突变型HERG的研究奠定了基础。     

hGPx-1-198Leu真核表达载体的构建与鉴定及在H9C2细胞中的表达

目的构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据。方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,通过限制性内切酶酶切目的片段和真核表达载体pEGFPN3,再用T4DNA连接酶将含有目的基因的片段定向插入到载体pEGFP-N3真核人巨细胞病毒启动子下游。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆、提取质粒进行鉴定。将hGPx-1-198Leu真核表达载体转染HEK293细胞,观察转染效率,并采用RT-PCR检测转染重组载体后细胞中GPx-1的mRNA表达水平。重组载体转染H9C2细胞,观察补硒之后的GPx-1表达情况。结果获得目的基因cDNA片段全长869bp,PCR和测序鉴定载体中含有人GPx-1-198Leu基因cDNA。重组载体转染HEK293细胞后检测到GPx-1的mRNA水平比未转染组及空质粒转染组明显升高,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制奠定了基础。H9C2细胞在转染后GPx-1蛋白水平升高并且随着硒浓度的升高而升高。结论成功构建了含Pro198Leu多态位点的hGPx-1真核表达载体,并且也插入了保证该基因有效表达的硒代半胱氨酸插入序列。     

反义HSP70真核表达载体的构建和在人喉癌细胞的表达

目的　进行促凋亡治疗喉癌实验 ,构建和鉴定携带反义HSP70 (heatshockprotein 70 )基因的真核表达载体。方法　将HSP70cDNA反向克隆入 pcDNA 3.1,构建CMV启动子控制的真核表达载体 pcDNA AHSP70 ,用酶切鉴定结果 ;应用该载体转染人喉表皮样癌细胞Hep 2 ,G4 18筛选阳性克隆 ;westernblot和免疫组化检测转染前后瘤细胞的HSP70的表达。检测转染前后瘤细胞的生物学性状。结果　获得 pcDNA AHSP70真核表达载体 ,HSP70反义RNA阻断了Hep 2细胞的HSP70的表达 ,经westernblotting和免疫组化证实 ,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70 ,而对照和空载体组高表达HSP70。转染反义HSP70的真核表达载体的Hep 2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢 ,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰 ,而空载体组没有。结论　本研究成功构建了反义HSP70真核表达载体并在人喉癌细胞得以表达。     

人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

目的 克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因,构建重组真核表达质粒,获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白.方法 应用RT-PCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RT-PCR鉴定基因转录,用免疫细胞化学染色法和Western Blot鉴定表达蛋白.结果经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因,表达蛋白具有免疫活性.结论成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核细胞中成功表达.     

基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因C1反式调节基因

目的对未知功能基因C1转染人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)后的基因表达谱进行分析,探索该基因的表达对肝细胞基因表达谱的影响及其可能的调节功能线索。方法以分子生物学技术构建C1的真核表达载体pcDNA3.1(-)-C1,以表达质粒pcDNA3.1(-)-C1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果HepG2细胞经转染C1表达质粒后,有26条差异表达基因,其中24条基因表达水平下调,2条基因表达水平上调。这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、细胞增生分化及肿瘤的发生密切相关。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了C1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明C1蛋白可能的生物学功能及乙型肝炎病毒核心蛋白的致病机制提供了理论依据。     

β-catenin依赖性 LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响

目的 探讨β-catenin依赖性LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆全长型LEF-1的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His中,脂质体法转染Hela细胞,G418筛选稳定表达目的 基因的细胞株,Western blot鉴定目的 基因的表达,MTT和平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,裸鼠体内成瘤实验检测β-catenin依赖性LEF-1亚型对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响.结果 成功构建LEF-1真核表达质粒,获得稳定表达β-catenin依赖性LEF-1亚型的HeLa细胞株,转染后的细胞增殖速度加快,凋亡水平降低,体内成瘤能力加强.结论 全长型LEF-亚型的上调表达对于HeLa细胞的部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用.     

重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响

目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力。     

放射诱导p16基因胰腺癌靶向性表达的研究

目的　构建 pcDNA3.1 Egr.1p-p16重组质粒并检测其在人胰腺癌 JF305细胞中的辐射诱导表达。方法　将人p16 cDNA基因连接到有辐射诱导特性的早期反应因子 Egr.1p的下游,构建成 pcDNA3.1 -Egr.1p- p16 重组质粒,利用脂质体介导转染人胰腺癌细胞系 JF305 细胞;采用 RT- PCR方法和 Western blot方法检测不同剂量 X射线照射后,被转染细胞中 p16 的转录和表达水平。结果　酶切鉴定证实 pcDNA3. 1 Egr. 1p -p16 重组质粒构建正确。被pcDNA3.1 Egr.1p -p16重组质粒转染的人胰腺癌 JF305细胞经不同剂量 X射线照射后,p16 基因表达均高于未照射组。结论　X射线可诱导 pcDNA3.1 -Egr.1p -p16重组质粒在人胰腺癌 JF305细胞中表达增强。     

小鼠Reg3α基因cDNA成功转染MIN6细胞株并促其生长

目的 建立一过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞株,研究其在低葡萄糖环境中的生长特性.方法 将全长Reg3α cDNA插入到质粒载体pcDNA3.1中,并将Reg3α pcDNA3.1和pcDNA3.1空载体用脂质体法转染胰岛MIN6细胞,分别获得Reg3α cDNA过表达和空载体pcDNA3.1MIN6细胞.应用Real time PCR和Western blot方法检测这两种细胞在低葡萄糖培养基中Reg3α的表达,并用MTT法测定Reg3α过表达对MIN6细胞生长的影响.结果 有三株Reg3α转染的细胞株显示Reg3α的高表达,在空载体转染的MIN6细胞株中未检测到Reg3α的表达,Reg3α mRNA和蛋白水平分别平均升高6～10倍.用Western blot检测发现Reg3α蛋白释放到培养液.采用MTT法测定,与空载体转染的MIN6细胞株相比,三株Reg3α稳定转染细胞株,7 d后细胞数目升高2倍.结论 本研究结果表明已成功地建立了过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞.Reg3α可能具有内分泌作用,促进胰岛细胞生长.     

葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的真核细胞表达和免疫分析

目的 验证葎草花粉主要变应原核酸疫苗(pcDNA3.1-LC2)能否在真核细胞内表达,并进行免疫原性、免疫保护作用、安全性等分析.方法 应用磷酸钙沉淀法将pcDNA3.1-LC2转染至HEK293细胞,提取RNA并行RT-PCR,利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,验证所分离出的条带与目的 片段是否一致;应用pcDNA3...     

Eukaryotic expression and biological activity analysis of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin

Objective To investigate the expression of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin (HNG) in eukaryotic cells by gene engineering technique and analyze its biological activity. Methods By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of HNG with FLAG in its C-terminal was obtained, which was cloned into the plasmid pcDNA3.1(-), and the resultant recombinant vector pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was transfected into PC12 cells. At the same time, the recombinant vector pcDNA3.1(-)/EGFP was transfected to control the efficiency of transfection. The expression of HNG in the cells was determined by immunocytochemistry. In order to analyze the biological activity of the expressed HNG, 25μM Aβ25-35 peptide was added to the culture medium of the transfected cells for 24h, then cell morphology, MTT assay and Hoechst 33258 staining were observed. Results The eukaryotic expression vector of pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was identified by enzyme digestion and sequencing. HNG was highly expressed in PC12 cells. After exposure of PC12 cells to 25μM Aβ25-35 for 24h, cell viability decreased to (65.8±5.3)%, and the dystrophic changes of neuritis and nuclei condensation were obvious. When cells were pre-transfected with pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG, Aβ25-35-induced cell death and morphological changes of cells and nuclei were suppressed. In contrast, pre-transfected with empty vector did not protect cells from Aβ25-35-induced toxicity. Conclusion The eukaryotic expression vector for FLAG-tagged HNG was successfully constructed and expressed in PC12 cells. Expressed HNG has biological activity.     

乙型肝炎病毒全X基因对HEK293细胞功能的影响

目的克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异。方法应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;Annexin V流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化。结果成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)%和(0.805±0.013)%,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)%和未转染对照组(0.681±0.018)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)%及(21.34±2.16)%,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)%及未转染细胞对照组(11.37±1.58)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用。     

重组小鼠血管抑素基因在胆囊癌细胞中的表达及对血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的　研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞能否表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白。方法　应用脂质体LipofectAMINE 2 0 0 0将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC SD ,G4 18抗性筛选 ;以Westernblot检测血管抑素的表达 ,以血管内皮细胞增殖分析检测其活性。结果　经Westernblot检测 ,得到高表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆 ,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖 (P <0 .0 5 )。结论　小鼠血管抑素基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转导的胆囊癌细胞能够表达具有生物学活性的血管抑素蛋白 ,在胆囊癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值     

人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建

目的通过生物技术获得促甲状腺激素受体膜外区表达载体,为TSHR膜外区的研究提供有力工具。方法从人甲状腺组织中提取总RNA,RT-PCR分离得到TSHR膜外区cDNA,双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。结果经酶切鉴定、测序分析表明TSHR膜外区片段与GenBank提供的完全相同。结论成功构建了人TSHR膜外区真核表达载体。     

原癌基因Fra-1高表达与乳腺癌细胞转移表型的关系

目的研究原癌基因Fra-1与人乳腺癌细胞系MCF-7细胞侵袭及迁移的关系。方法提取乳腺癌细胞系MDA231细胞的总RNA,通过RT-PCR扩增Fra-1全长基因,将其克隆入pcDNA3.1(-)myc-his表达载体;应用脂质体法转染MCF-7细胞,观察Fra-1过表达对MCF-7细胞增殖、黏附和迁移的影响。结果高表达Fra-1增强了MCF-7细胞的增殖、黏附和迁移的能力。结论原癌基因Fra-1可能通过促进肿瘤细胞的增殖、黏附和迁移,在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥作用。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。