大鼠海马组织RNA、DNA和蛋白质共提取方法的研究

目的探讨Trizol法同时提取大鼠单侧海马组织RNA、基因组DNA和蛋白质的可行性及优势。方法 Trizol法提取成年雄性Sprague-Dawley大鼠单侧海马组织RNA、基因组DNA以及蛋白质;商业化试剂盒提取另一侧海马组织基因组DNA,RIPA裂解液提取蛋白质。用超微量分光光度计和SYBR实时定量RT-PCR法检测Trizol法提取的RNA的质量,利用超微量分光光度计和聚合酶链式反应(PCR)法比较两种方法提取DNA的效果及质量,采用Western blot法比较两种方法提取蛋白质的效果。结果 Trizol法提取单侧海马RNA的质量浓度介于1 178.3² 225.8ng/μL之间,A260/280介于2.012 225.8ng/μL之间,A260/280介于2.01².03,A260/230介于1.882.03,A260/230介于1.88².22,并获得了稳定的β-actin和GR循环域值。Trizol法和试剂盒提取单侧海马DNA的质量浓度分别介于215.72.22,并获得了稳定的β-actin和GR循环域值。Trizol法和试剂盒提取单侧海马DNA的质量浓度分别介于215.7²71.8ng/μL和268.6271.8ng/μL和268.6⁸72.5ng/μL之间,均适于充当PCR反应模板。Trizol法和RIPA裂解液提取的蛋白质在Western blot法检测目的蛋白含量的过程中均呈现清晰的条带。结论 Trizol法提取大鼠单侧海马组织RNA的同时提取的DNA和蛋白质,与商业化试剂盒和RIPA裂解液从不同海马组织中分别提取基因组DNA和蛋白质的效果相当。采用Trizol法同时提取海马组织的RNA、DNA和蛋白质,不仅提高了实验效率、节约了实验成本,而且有效避免了因反复实验操作带来的人为干扰及误差。     

葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的真核细胞表达和免疫分析

目的 验证葎草花粉主要变应原核酸疫苗(pcDNA3.1-LC2)能否在真核细胞内表达,并进行免疫原性、免疫保护作用、安全性等分析.方法 应用磷酸钙沉淀法将pcDNA3.1-LC2转染至HEK293细胞,提取RNA并行RT-PCR,利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,验证所分离出的条带与目的 片段是否一致;应用pcDNA3...     

胰高血糖素样肽-1类似物(JC003)对糖尿病大鼠血糖及胰岛功能的影响

目的探讨胰高血糖素样肽-1类似物(JC003)对实验性糖尿病血糖和胰岛功能的影响。方法84只Wistar大鼠,采用高脂饮食和注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ)方法建立实验性糖尿病动物模型。JC003治疗14 d后,采用酶化学方法检测空腹血糖;采用放射免疫方法检测血清胰岛素和C肽。胰腺组织切片HE染色和链霉菌抗生物素-过氧化物酶(SABC)免疫组化染色方法对胰岛结构和胰岛素表达情况进行观察。结果JC003中剂量组(10μg/kg)、高剂量组(100μg/kg)与糖尿病模型组比较血糖明显降低(P<0.01);中剂量组(10μg/kg)、高剂量组(100μg/kg)的血清胰岛素和C肽水平明显高于糖尿病模型组(P<0.05);JC003各剂量组对糖尿病大鼠的胰岛组织结构有显著的保护作用,并且可以增加胰岛素表达阳性的β细胞(P<0.01)。结论JC003可以通过保护大鼠胰岛细胞免受STZ的伤害和增加胰岛β细胞数量来增加胰岛素的表达和分泌,从而降低糖尿病动物血糖。     

一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用

目的建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值。方法将含有目的质粒的菌株扩增后,运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取,微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率。结果改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2 mg/L菌液,A260/280=1.91;内切酶酶切完全;质粒DNA以超螺旋结构为主;真核细胞转染效率为20%左右。结论改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用,获得质粒DNA产量多、质量高,能达到分子生物学常规实验的要求。     

柴芍承气汤对重症急性胰腺炎大鼠肠道肌间神经丛NOS神经元的影响

目的 探讨肠神经系统在大鼠重症急性胰腺炎肠动力紊乱时的变化以及柴芍承气汤对大鼠肠道肌间神经丛内一氧化氮合成酶(nNOS)神经元表达的影响.方法 将30只SD大鼠随机分为3组:假手术组、模型组、柴芍承气汤组(CSCQD组);模型组和CSCQD组经胰胆管逆行注射质量浓度为50g/L的牛磺胆酸钠建立大鼠SAP模型后,分别给予生理盐水和CSCQD药液.测定大鼠的胃肠传递时间,HE染色光镜下观察胰腺的病理变化,用双重免疫荧光染色法观察回肠及结肠肌间神经丛NOS神经元的变化.结果 与模型组相比,CSCQD组传递指数(TI)明显升高(P<0.05),胰腺组织病理损害明显减轻(P<0.05),NOS神经元占总神经元的百分比明显降低(P<0.05).结论 CSCQD通过逆转肠神经系统NOS神经元的可塑性变化,改善SAP大鼠的肠动力,同时减轻了胰腺的病理损伤.     

“鸟枪”蛋白组学技术鉴定牙龈卟啉单胞菌47A-1亚型外膜蛋白

目的利用shotgun(鸟枪)蛋白质组学策略鉴定牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)亚型47A-1外膜蛋白,深化P.g外膜蛋白的蛋白质组学研究,为进一步研究P.g外膜蛋白的致病性奠定基础。方法提取P.g47A-1外膜蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白,胶内酶解为多肽混合物,应用毛细管高效液相色谱加串联质谱分析,SEQUEST程序进行数据库搜索并鉴定蛋白。结果用考马斯亮蓝法染色凝胶分离的蛋白,发现P.g47A-1蛋白条带主要在14.3~97 ku之间。酶解的肽段经毛细管高效液相色谱分离,得到肽段水平的总离子流图,分析肽段序列后发现P.g47A-1蛋白有623个唯一肽段,鉴定出136种蛋白,包括了51种已知蛋白,85种未知蛋白。结论 Shotgun技术可分析出P.g47A-1大量未知蛋白,尤其是丰度低、疏水性强的外膜蛋白,优于二维凝胶电泳(two dimensional gelelectrophoresis,2-DE)等传统蛋白质组学方法,为进一步研究P.g外膜蛋白的致病性奠定了基础。     

右美托咪定对离体大鼠肠系膜动脉炎性相关蛋白表达的影响

目的研究右美托咪定(DEX)对大鼠肠系膜动脉肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)及凋亡相关因子Caspase-3表达旳作用。方法取SPF级SD雄性大鼠,脱臼处死后,在体视显微镜下分离取出肠系膜动脉。建立脂多糖(LPS)诱导的血管损伤实验模型,并根据随机化原则将损伤血管分为DEX组和对照组。DEX组根据所给予DEX的浓度不同分为10~(-8)、10~(-7)、10~(-6) mol/L 3个亚组。分离提取各组动脉组织中RNA及总蛋白后,RT-PCR方法检测TNF-α、IL-1β及CaSR等因子的mRNA水平;Western blot检测TNF-α、CaSR、AMPK及Caspase-3等蛋白的表达变化。结果 10~(-8)、10~(-7)、10~(-6) mol/L DEX组中LPS诱导的血管炎性反应均明显降低,TNF-α的mRNA和蛋白表达及IL-1β的mRNA表达减弱。DEX组血管条的Caspase-3蛋白表达较LPS组显著降低。DEX对LPS诱导的血管AMPK蛋白表达和CaSR的mRNA表达没有明显作用。结论 DEX明显降低与炎症相关蛋白的表达,提示DEX有一定的抗炎症作用。     

长期应用糖皮质激素对大鼠股骨头骨组织MMPs/TIMPs系统的影响

目的观察长期应用糖皮质激素对大鼠股骨头骨组织中基质金属蛋白酶(MMPs)/基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)系统的影响,探讨长期应用糖皮质激素导致股骨头坏死的相关机制。方法健康SD大鼠40只,雌雄各半,随机分为低、中、高剂量激素组和对照组,每组10只。低、中、高剂量组动物分别给予肌肉注射醋酸泼尼松龙7、12.5、25mg/kg体重,每周2次;对照组给予相同体积生理盐水肌注。4周后取左侧股骨头骨组织石蜡包埋,HE染色,鉴定股骨头坏死情况;取右侧股骨头骨组织提取总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA表达水平。结果高、中、低剂量激素组和对照组动物初期股骨头坏死发生率分别为83.33%(5/6)、66.67%(6/9)、30%(3/10)、0(0/10);各激素组与对照组比较,MMP-2、MMP-9mRNA表达增高,与激素用量呈正相关,其中,中、高剂量激素组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);TIMP-1、TIMP-2mRNA表达水平降低,且与激素用量呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期应用糖皮质激素致股骨头坏死的效应可能与其调控MMPs/TIMPs系统表达有关。     

阿仑膦酸钠对长期应用皮质激素大鼠股骨头骨组织OPG/RANKL mRNA 表达的影响

目的 观察阿仑膦酸钠对长期应用皮质激素大鼠骨组织中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子κB受体活化因子配基(RANKL)mRNA表达的影响,探讨其预防激素性股骨头坏死的效果及作用机制.方法 健康SD大鼠30只,雌雄各半,随机分为激素组、阿仑膦酸钠组和空白对照组,每组10只.激素组和阿仑膦酸钠组给予肌肉注射醋酸泼尼松龙12.5mg/kg体重,每周2次,阿仑膦酸钠组同时给予阿仑膦酸钠5mg/kg体重灌胃,1次/周;对照组只给予相同体积生理盐水肌注.4周后取左侧股骨头骨组织,石蜡包埋,HE染色,鉴定骨质疏松和股骨头坏死情况;取右侧股骨头骨组织提取总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(RTQ-PCR)技术检测OPG mRNA和RANKL mRNA的表达水平,计算OPG/RANKL比值.结果 激素组、阿仑膦酸钠组及对照组的动物死亡率分别为10%(1/10)、10%(1/10)、0(0/10);股骨头坏死率分别为66.67%(6/9)、22.22(2/9)、0(0/10);股骨头骨组织OPG mRNA的相对表达量分别为0.96±0.16、1.35±0.26和1.60±0.49,RANKL mRNA的相对表达量分别为3.33±1.04、1.98±0.51和1.58±0.42,激素组与对照组比较,其OPG mRNA的表达水平降低,RANKL mRNA表达升高,OPG/RANKL比值下降,差异有统计学意义(P<0.05);阿仑膦酸钠组与对照组比较,差异无统计学意义.结论 ①糖皮质激素醋酸泼尼松龙能下调大鼠骨组织OPG mRNA的表达水平,上调RANKL mRNA水平,使OPG/RANKL比值下降;②阿仑膦酸钠预防激素性股骨头坏死可能与其拮抗皮质激素对OPG mRNA和RANKL mRNA表达的调控有关.     

长期应用糖皮质激素对大鼠股骨头骨组织OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的观察长期应用糖皮质激素对大鼠股骨头骨组织中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子kappa B受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor kappa Bligand,RANKL)mRNA表达的影响,探讨长期应用糖皮质激素导致股骨头坏死的另一作用机制。方法健康SD大鼠40只,雌雄各半,随机分为低、中、高剂量激素组和对照组,每组10只。低、中、高剂量激素组动物分别给予肌肉注射醋酸泼尼松龙7、12.5、25mg/kg体重,每周2次;对照组给予相同体积生理盐水肌注。4周后取左侧股骨头骨组织石蜡包埋,HE染色,鉴定股骨头坏死情况;取右侧股骨头骨组织提取总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测OPG和RANKL mRNA的表达水平并计算OPG/RANKL比值。结果①低、中、高剂量激素组和对照组动物初期股骨头坏死发生率分别为30%(3/10)、66.67%(6/9)、83.33%(5/6)、0(0/10);②低、中、高剂量激素组和对照组动物股骨头骨组织OPG mRNA表达的相对量分别为1.12±0.17、0.96±0.16、0.83±0.18和1.60±0.49;RANKL mRNA表达的相对量分别为2.48±0.81、3.33±1.04、4.51±1.33和1.58±0.42。与对照组比较,3个激素组OPG mRNA表达降低,且与激素用量呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05);RANKL mRNA表达增高,与激素用量呈正相关,其中中、高剂量组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期应用糖皮质激素致股骨头坏死的效应可能与其调控OPG和RANKL mRNA表达有关。