GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建

目的构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法将T-h GM-CSF重组质粒转化入感受态大肠杆菌中,筛选出耐药性单克隆菌落送测序。利用PCR技术扩增出GM-CSF目的基因片段,将PCR产物连入pGEM-T easy载体,转化入大肠杆菌中扩增,用SDS碱裂解法提取Teasy-GM-CSF重组质粒,用限制性内切酶酶切Teasy-GM-CSF重组载体,连入经相同酶酶切的pLXSN反转录病毒载体中。用磷酸钙沉淀法转染PA317包装细胞系进行病毒包装,用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19细胞,经G418加压筛选感染成功的NuTu-19/GM-CSF细胞,用免疫细胞化学和ELISA法检测NuTu-19/GM-CSF分泌表达GM-CSF蛋白的情况。结果T-h GM-CSF重组质粒测序结果与GenBank Accession#:NM_000758基因序列对比后确定为人类GM-CSF基因编码序列;PCR产物酶切电泳在Mark 400-500 bp中有一条带,符合GM-CSF基因序列长度;重组Teasy-GM-CSF质粒用EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切后,电泳鉴定在400-500 bp之间有一目的条带,重组反转录病毒质粒pLGM-CSFSN酶切电泳有目的条带;G418加压筛选感染后的NuTu-19细胞,14 d后慢慢形成单克隆继续生长;免疫细胞化学检测到感染成功的NuTu-19细胞膜表面有明显的棕褐色颗粒沉淀,ELISA法检测细胞培养上清液中GM-CSF的质量浓度为150 pg/mL。结论成功构建了能分泌表达人GM-CSF蛋白的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF,为以后研究卵巢癌免疫治疗提供必备、有效、可靠的工具基础。