| 摘 要： | 目的构建携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默CIP2A表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成CIP2AshRNA,退火形成双链与pDC316-EGFP-U6质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒pDC316-EGFP-CIP2AshRNA,以鉴定正确的pDC316-EGFP-CIP2AshRNA克隆为模板PCR扩增EGFPCIP2AshRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR扩增产物及pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA,建立载体细胞株BHK/CIP2A-shRNA,采用AAV MaxTM包装系统大规模制备rAAV2-EGFPCIP2AshRNA并对其纯化及滴度测定。将rAAV2-EGFP-CIP2AshRNA感染肝癌细胞HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP作对照,采用Real-time PCR及Western blot方法检测CIP2AshRNA基因沉默效果。结果携带编码CIP2AshRNA腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;将重组质粒与辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-21,成功制备重组腺相关病毒rAAV2-CIP2AshRNA,经测定纯化所得rAVV2病毒滴度为0.25×1012v.g./mL。筛选MOI值为1×105感染肝癌细胞HepG2,CIP2A mRNA及蛋白表达水平分别于感染后24h和48h与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体rAAV2-CIP2AshRNA。
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