| 摘 要： | 目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以EcoRⅠ和BamHⅠ将腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%～94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10~(13)vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的hTSHR289蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。
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