分泌抗RSV单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本实验用呼吸道合胞病毒(RSV)Long 株免疫的 BALB/c 小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/o 融合,经次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)选择培养,获得5株抗体阳性杂交瘤细胞株.将2F4株3次克隆化,阳性率100%。连续传代3个月和液氮冻存3个月后仍能稳定分泌 RSV 单克隆抗体(McAb)。该抗体属 IgGl亚类.只与 RSV 抗原反应;能中和 RSV 的感染性;可被 RSV Long 株感染的 Hep-2细胞吸收.ELISA 测定,2F4株上清和腹水效价分别为10~(-2)和10~(-7)。4℃保存3个月其抗体活性无明显变化.     

UL2基因与HSV-1在三叉神经节中潜伏感染的相关性

目的　深入了解UL2基因与HSV 1在三叉神经节潜伏感染的相关性。方法　选择HSV 1国际参考标准株F株、HSV 1RE(株 ) (UL2基因插入突变株 )和其亲代HSV 1△ 30 5株 (TK- )三株病毒进行对比分析研究。对三株HSV 1病毒腹腔免疫接种小鼠双侧三叉神经节分别进行PCR扩增。结果　HSV 1 (RE)和HSV 1 (△ 30 5)组HSV 1潜伏感染率明显低于HSV 1 (F)组 (P <0 0 2 5) ,提示UL2基因可能在HSV 1形成潜伏感染过程中起一定作用。经HSV 1 (F)病毒攻击实验后三个实验组小鼠 ,其潜伏感染率无明显变化 ,而对照组小鼠潜伏感染率明显高于HSV 1 (RE)组和HSV 1 (△ 30 5)组 (P <0 0 1 )。结论　HSV 1 (RE)株的免疫接种可以预防HSV 1潜伏感染的建立。同时也为HSV 1RE株作为神经系统疾病基因治疗载体提供了理论依据     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步免疫观察

目的　构建用于防治单纯疱疹的核酸疫苗并观察其免疫效果。方法　用PCR反应 ,从HSV 1F株基因组DNA中扩增出 gD蛋白的全部编码序列 ,将其插入 pcDNA 3 1 (+)的PCMV下游 ,构建HSVgD核酸疫苗 ,并用酶切分析和测序鉴定 ;通过中和试验、ELISA方法和攻击试验检测用 pLy D三次肌肉接种小鼠的免疫效果。结果　经鉴定证实了HSV gD核酸疫苗 pLy D的构建 ;实验小鼠产生了对HSV 1特异性的抗体 (抗体滴度 :ELISA法 1∶2 0 3,中和试验法 1∶37) ,并经受了HSV 1病毒的攻击 (存活率 :70 % )。结论　成功构建出了HSV gD核酸疫苗pLy D ,用其接种小鼠可以诱导产生特异性免疫反应 ,并具有良好的保护作用。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV—1)基因突变株的生物学特性初步研究

应用病毒空斑滴定法及动物LD_(50)法对HSV-1基因插入突变株[HSV-1(RC)]的生物学特性进行了初步研究。发现HSV-1(RC)株在不同的6种细胞系上能够生长繁植,但在BHK-21、Hep-2细胞上较其亲代HSV-1(Δ305)及HSV-1(F)株生长缓慢,且空斑形成单位(pFU)数明显低于亲代株。动物LD_(50)实验结果HSV-1(F)株LD_(50)值为2.9×10~4pFU/0.1ml,而HSV-1(6305)及HSV-1(RC)LD_(50)值为0。实验结果提示:HSV-1基因组BamHI C片段插入突变处不是该病毒在一些细胞培养上生长所必需的基因片段,但对在某些细胞系上的生长仍具有影响作用。HSV-1的TK基因和BamHI C片段插入突变处则是病毒在动物整体上毒力强度的必需基因。在HSV-1基因组BamHI C片段处插入9.7kb大小的外源基因并不影响病毒在细胞上的组装和繁殖,但其毒力降低,建立的实用空斑滴定技术适用于病毒学研究,有推广应用价值。     

体外简便快速增产大鼠杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的方法对比研究

本文报告了以抗肾综合征出血热病毒(HFRSV)大鼠单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系为模型,研究比较了用常规营养液添加培养法与静置细胞培养法(非添加培养)生产大鼠McAb的产量和滴度的效果。结果表明应用静置细胞培养法,McAb的产量明显高于添加细胞培养法2～3倍,抗体效价亦增加至少一个数量级,并且有简便易行、快速省时、减轻劳动强度和节省原材料的特点,值得试用。     

抗鸭乙肝病毒core蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗鸭乙肝病毒core蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。方法 PCR扩增鸭乙肝病毒(DHBV)core基因片段,构建表达载体pET28a(+)/DHBV core。转化诱导表达融合蛋白,用Ni 2+亲和柱纯化目的蛋白。免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选,采用有限稀释法筛选单克隆杂交瘤细胞并进行细胞克隆。体内诱生法大量制备单克隆抗体,进行抗体的特异性、效价和亚型的鉴定。结果成功构建表达载体pET28a(+)/DHBV core,并表达DHBV core蛋白。获得2株稳定分泌抗DHBV core抗体的杂交瘤细胞株,分别为2D7和5G10,细胞培养液抗体效价为1∶400和1∶800。选择5G10细胞株制备单克隆抗体,小鼠腹水抗体效价可达1∶320 000。鸭肝组织免疫组化结果显示,DHBV病毒载量>1010copies/mg的肝组织中DHBV core蛋白的表达明显高于病毒载量<105copies/mg的肝组织,而未感染DHBV的鸭肝细胞内不表达DHBV core蛋白。亚型鉴定结果为IgG2aκ链。结论制备并获得了抗DHBV core蛋白的单克隆抗体,为DHBV core蛋白的功能研究、诊断试剂的研制与抗病毒治疗研究奠定了基础。     

HSV—1在小鼠体内的感染与分布

实验选用BALB/c小鼠作为感染对象,经腹腔接种10 LD_(50)HSV-10.3ml,24h内即可出现病毒血症,并持续到小鼠死亡。同时在肝、脾分离到病毒,48h后在肺、肾组织中分离到病毒,120h后在脑组织中分离到病毒。所分离的病毒经免疫荧光,ELISA法检测确属HSV-1。感染小鼠均在120h～144h内全部死亡,死前有麻痹等脑炎症状。电镜下可见脑组织有炎性病理变化,并在细胞内。外找见典型的HSV颗粒。     

双靶向诱导超抗原TSST-1基因重组逆转录病毒的包装及鉴定

目的包装出携5拷贝缺氧反应元件(5 HRE)增强子和癌胚抗原启动子(CEAp)联合调控的超抗原中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)基因的逆转录病毒,并建立稳定表达TSST-1的人结肠癌Lovo细胞株。方法应用已构建好的逆转录病毒载体pLEGFP-N1-5 HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM,与辅助质粒pMB-MLV、pMB-G共转染入293T细胞,LaSRT法检测病毒滴度。包装出的逆转录病毒感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo和CEA阴性的人宫颈癌细胞株Hela。应用RT-PCR和免疫组化方法鉴定TSST-1的表达。结果获得重组逆转录病毒滴度约为1×106CFU/mL。RT-PCR及免疫组化证实经病毒感染的Lovo细胞在mRNA和蛋白水平均有TSST-1表达,缺氧环境中的mRNA表达量更高,且细胞传代20次后依然有TSST-1 mRNA表达;经病毒感染的Hela细胞在常氧或缺氧状态下均无TSST-1 mRNA及蛋白表达。结论包装出较高滴度重组逆转录病毒,并能靶向性在CEA阳性肿瘤内稳定表达TSST-1,为后续检验TSST-1对肿瘤的杀伤效应奠定了基础。     

携带CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

目的构建携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默CIP2A表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成CIP2AshRNA,退火形成双链与pDC316-EGFP-U6质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒pDC316-EGFP-CIP2AshRNA,以鉴定正确的pDC316-EGFP-CIP2AshRNA克隆为模板PCR扩增EGFPCIP2AshRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR扩增产物及pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA,建立载体细胞株BHK/CIP2A-shRNA,采用AAV MaxTM包装系统大规模制备rAAV2-EGFPCIP2AshRNA并对其纯化及滴度测定。将rAAV2-EGFP-CIP2AshRNA感染肝癌细胞HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP作对照,采用Real-time PCR及Western blot方法检测CIP2AshRNA基因沉默效果。结果携带编码CIP2AshRNA腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;将重组质粒与辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-21,成功制备重组腺相关病毒rAAV2-CIP2AshRNA,经测定纯化所得rAVV2病毒滴度为0.25×1012v.g./mL。筛选MOI值为1×105感染肝癌细胞HepG2,CIP2A mRNA及蛋白表达水平分别于感染后24h和48h与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体rAAV2-CIP2AshRNA。     

β-分泌酶底物肽反转录病毒载体及其包装细胞株的构建

目的用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株。方法根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后连接,构建成表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体。用脂质体介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选后,挑单克隆扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株。结果经酶切、连接后构建成的质粒称为pLXSN-BACEsp,经测序证实构建成功,无任何碱基突变。经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立BAC-Esp高效表达的包装细胞株。结论成功构建了能表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立了稳定、高效地产生有活性的BACEsp产毒包装细胞株。     

单纯疱疹病毒性角膜炎土贝母皂甙点眼的浓度筛选与刺激性评价

目的　通过动物试验评价土贝母皂甙 (tubeimoside ,Tu)治疗单纯疱疹病毒性角膜炎 (herpessimplexkeratitis ,HSK)的效果及点眼刺激性 ,并确定其点眼浓度值。方法　根据药物的眼刺激性选用 5、2、0 .8、8× 10 -2 、8× 10 -3、8× 10 -4 g·L-1Tu点眼 ,确定 0 .4、0 .2、0 .1g·L-1评价药物疗效。在地鼠肾细胞BHK 2 1上进行单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV 1型 )SM4 4毒株复苏 ,制作兔HSK模型。采用裂隙灯显微镜、扫描电镜和透射电镜观察眼部病变的动态变化评价Tu疗效。结果　 5、2 g·L-1Tu有中度刺激性 ,0 .8g·L-1Tu有轻度刺激性。 8× 10 -2 、8× 10 -3、8× 10 -4 g·L-13组Tu无任何眼刺激性。 0 .4g·L-1Tu有轻度刺激性 ,0 .1、0 .2 g·L-1Tu无刺激性。 0 .4、0 .2、0 .1g·L-13组Tu均具有一定疗效。结论　Tu点眼剂的浓度与刺激性呈正相关 ,点眼刺激性从轻度到无的界值浓度为 0 .4、0 .2、0 .1g·L-1。治疗实验性HSK有一定的疗效 ,但尚不及无环鸟苷     

单纯疱疹病毒2型gG-2"独特区"基因的原核表达及其血清学诊断价值

目的在大肠杆菌中表达HSV-2的gG-2"独特区"基因(gG-2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV-2的gG-2T,并在大肠杆菌中表达gG-2T融合蛋白。通过Western blot和间接ELISA鉴定融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的gG-2T融合蛋白可以与GST多克隆抗体结合并在46 ku附近出现特异性结合条带。并且能够与确诊的HSV-2患者血清反应,而不与HSV-1患者血清和正常人血清反应。结论获得了HSV-2 gG-2T融合蛋白,它可以与GST多克隆抗体特异性结合并且可以同HSV-2型患者血清特异性反应;获得的gG-2T蛋白为研究以gG-2蛋白作为靶区域的诊断试剂盒和疫苗研发打下实验基础。     

β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备

目的　制备稳定分泌β -淀粉样肽 1～ 4 2 (Aβ1-42 )单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,产生高效价抗体。方法　通过基因工程技术 ,将Aβ1-42 基因融合于乙肝核心抗原 (HBcAg)的主要免疫优势区 (MIR) ,制备Aβ和HBcAg的融合蛋白 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0细胞融合 ,筛选能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果　得到两株能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,Aβ1-42 单克隆抗体的Ig亚类为IgG3 。结论　制备得到的Aβ1-42 单克隆抗体特异性强 ,效价高     

土贝母皂甙对家兔单纯疱疹病毒性角膜炎的作用

目的评价土贝母皂甙(tubei moside,Tu)治疗家兔单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes si mplex keratitis,HSK)的效果。方法在地鼠肾细胞BHK-21上进行单纯疱疹病毒I型(HSV-1型)SM44毒株复苏,制作兔HSK模型。家兔分为0.2g/L Tu、无环鸟苷(ACV)和生理盐水(NS)3组,采用裂隙灯显微镜、扫描电镜和透射电镜观察眼部病变的变化。结果0.2g/L Tu、无环鸟苷和生理盐水组第6~8天角膜病变分值分别为3.13~3.5、1.75~1.88和3.83~3.88,第14天时为2.07、1.13和2.77,3组间比较,均有显著性差异(P<0.01)。0.2g/L Tu可以显著缩小角膜病变面积,促进角膜上皮细胞的修复,其作用优于生理盐水组,但不及ACV组。结论Tu点眼剂治疗实验性HSK有一定的疗效,但尚不及ACV。     

三氧化二砷诱导卵巢癌细胞株COC1发生G_1期阻滞

目的研究三氧化二砷(As2O3)诱导卵巢癌细胞株COC1凋亡的作用机理。方法用不同浓度的As2O3溶液作用人卵巢癌细胞株COC1,于不同时间点收集细胞,MTT法检测细胞生长抑制率,原位末端标记法(TUNEL)观察细胞凋亡形态学特征,流式细胞仪检测细胞凋亡率及分析细胞周期的变化。结果随着药物浓度的升高、作用时间的延长,As2O3对COC1细胞的生长抑制率逐渐升高,具有浓度和时间依赖性;COC1细胞在1.5μmol/LAs2O3作用48h就出现了凋亡形态学改变,且随着作用时间的延长凋亡细胞数量增多;在3.0μmol/L、1.5μmol/LAs2O3作用下COC1出现了明显的凋亡峰,细胞周期也出现了随着药物作用时间的延长G1期细胞比例逐渐上升,S期、G2/M期细胞的比例同时降低的现象,提示As2O3对人卵巢癌细胞株COC1有明显周期特异性生长抑制作用。结论As2O3可以诱导卵巢癌细胞株COC1发生凋亡,诱导细胞发生G1期阻滞是As2O3抑制卵巢癌细胞生长作用的可能机制之一。     

ASSOCIATION ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN SIX GENES WITHIN THE GH/IGF-1 AXIS IN PATIENTS WITH IDIOPATHIC SHORT STATURE IN THE CHINESE HAN POPULATION

Objective To investigate relationships of polymorphisms in six genes ( GHR,IGF-1,IGF-1R,IGFBP-3,JAK2,and STAT5b) in the growth hormone ( GH)/insulin-like growth factor-1 (IGF-1) axis with idiopathic short stature (ISS) in the Chinese Han population. Methods A casecontrol study was carried out on a cohort of 198 ISS patients and 306 healthy controls.A total of 106 tagging single nucleotide polymorphisms (tagSNPs) from the six genes were selected from the HapMap ( haplotype map of the human genome ) Han Chinese in the Beijing subset.Results of genotyping conducted by highthroughput Illumina GoldenGateTM Assay were analyzed by statistical software. Results Both individual tagSNPs and haplotypes showed an association with ISS in the Hun Chinese population ( P ＜ 0.05 ).For each single test,both allele and genotype were tested.By allele frequency analysis,six positive SNP sites ( rsNo.1,rsNo.2,rsNo.3,rsNo.4,rsNo.5,and rsNo.6 ) of 3 genes ( JAK2,IGF-1R,and GHR) were found having associations with ISS. By genotype frequency analysis, there were significant differences between the patient and control groups in the following SNP sites:4 sites in JAK2 gene ( rsNo.1,rsNo.2,rsNo.3,and rsNo.4 ) and 1 site in GHR gene ( rsNo.6 ).The risk which affected ISS was found related to the JAK2 gene in 4 sites ( increase in rsNo.1 and decrease in rsNo.2,rsNo.3,and rsNo.4) and to the GHR gene in 1 site (decrease in rsNo.6).They were four haplotypes in gene of IGF-1R as “ TGC","CGCT",”TA",and "CA",one haplotype in IGFBP-3 as "TA",and one haplotype in JAK2 as "CTG",which revealed high significance for risks of affecting ISS. At last,multivariate logistic regression analysis of specific site rsNo.6 of the GHR gene revealed that the serum IGF-1 was related to genotypes AA and AC,with genotype CC as the reference ( P =0.015). Conclusion Genetic variances in six genes within the GH/IGF-1 axis may be important etiological factors for ISS in the Chinese Han population.     

Preliminary study on Salvia miltiorrhiza bung endophytic fungus

Objective To select the strains which can produce tanshinone ⅡA like its host plant Salvia miltiorrhiza bung. Methods A total of 50 strains of endophytic fungi were isolated from healthy, living and symptomless tissues of Salvia miltiorrhiza bung, among which 29 strains were obtained from the root, 14 from the stem, 3 from the leaf, 3 from the flower and 1 from the seed. Their antimicrobial activities against nine different bacteria, including both Gram-negative and Gram-positive bacteria, were measured by Oxford plate agar diffusion bioassay. Results Our data showed that all but four strains had significant antibacterial activities on at least one indicator bacterium to some extent, and five strains (DR1, DR4, DR16, DR18 and DF2) manifested quite prominent antibacterial activities against certain pathogenic bacteria. In some degree, it might indicate that this endophytic fungus isolated from the tissues of Salvia miltiorrhiza bung has a potential value as a natural antibacterial medicine as well. Thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) were carried out to test selected strains, both inside and outside of the cell to see if any strain can produce tanshinone ⅡA. The result showed that extracts from three strains, labeled as DR12 (outside cell), DR21 (inside cell) and DF3 (inside cell), had a component with the same Rf value in TLC assay as that of authentic tanshinone ⅡA. The extract from DR12 (outside cell) and DR21 (inside cell) had a peak at retention time identical to that of authentic tanshinone ⅡA in HPLC. Conclusion The fungi appear to produce the bioactive compound tanshinone ⅡA, and they could be used to produce tanshinone ⅡA by fermentation. It provides a new way to synthesize this natural medicine.     

蛋白酶活化受体-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备蛋白酶活化受体-1(PAR-1)单克隆抗体(mAb)。方法以PAR-1特异性片段为免疫原(13肽)免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗PAR-1 mAb。采用捕获酶联免疫吸附试验(capture ELISA)鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、Dot blot、免疫组化染色法、流式细胞仪分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性。结果获得2株可稳定分泌抗PAR-1 mAb的杂交瘤细胞,其亚型分别为IgMI、gG2b。免疫组化染色表明,mAb与人扁桃体、结肠组织中的淋巴细胞、包皮组织中的成纤维细胞、肺组织中的巨噬细胞反应呈阳性。流式细胞仪分析显示,2株mAb与人肺腺癌细胞系A549细胞胞浆内及细胞膜上的PAR-1均呈阳性反应。激光共聚焦扫描显微镜观察,荧光标记的阳性反应物在A549细胞胞浆内及细胞膜上均可见。结论成功地制备出抗PAR-1 mAb,为进一步研究炎症性疾病提供有用的试剂。