产纤维素酶细菌的分离鉴定及产酶特性研究

从青藏高原采集的牦牛粪中,经过CMC平板分离得到潜在产胞外纤维素酶菌株6株,运用透明圈法和滤纸崩解法得到产纤维素酶能力较强的一株细菌Tibet-YD5000-3,革兰氏染色和16S rDNA序列比对分析表明,Ti-bet-YD5000-3菌株为革兰氏阴性菌,属黄杆菌属（Flavobacterium sp.）细菌,Tibet-YD5000-3最适生长温度为20℃,最适生长pH值为8.0,最适产酶温度25℃,最适产酶pH值为8.0.该菌株所产的纤维素酶都具有较好的热稳定性和宽泛的pH适应性.     

纤维素降解菌的分离鉴定及固态发酵条件

从腐烂稻草、土壤和牛粪等样品中分离到12株能在以CMC-Na(羧甲基纤维素钠)为唯一碳源的固体培养基上生长的菌株,并从中筛选出1株分解纤维素能力较强的真菌,初步鉴定为脉纹孢菌(Neurospora sp.).通过对其固态发酵条件进行单因素优化试验,初步确定了发酵培养基最佳碳、氮源种类及添加量:稻草粉与麸皮的质量比为9∶1,NH4NO30.5%;最适培养条件为:固液比1∶3,接种量1 mL,pH值自然,培养温度30℃,培养时间96 h.该菌株的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别达到3 551.1和386.7μmol/(g.h).     

一株产碱性CMC酶链霉菌的筛选及酶学性质研究

经CMC平板分离筛选,从青藏高原牦牛粪样品中获得一株产碱性CMC酶能力较强的菌株Tibet-YD4524-3,16S rRNA基因序列初步鉴定其为链霉菌类(Streptomyces sp.)菌种.生物学特性的研究表明,Tibet-YD4524-3产酶的最佳碳源为可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠,最佳氮源为酵母膏,最适产酶温度为30℃,最适产酶p H值为8.0.酶学性质初步研究显示,Tibet-YD4524-3产生的CMC酶最适反应温度40℃,最适反应p H值为8.5,在碱性条件下CMC酶具有较高的酶活性和较好的稳定性.金属离子K~+、Mn~(2+)和Fe~(2+)对Tibet-YD4524-3所产CMC酶的反应具有促进作用,金属离子Cu~(2+)、Pb~(2+)和Hg~(2+)具有抑制CMC酶反应的作用.     

产不同β-内酰胺酶产气肠杆菌基因型及同源性分析

目的了解医院感染产气肠杆菌产β-内酰胺酶的基因型情况,并对其同源性进行分析。方法β-内酰胺酶试验与基因型检测(包括4个超广谱β-内酰胺酶基因:blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-3、blaCTX-M-9基因与1个AmpC酶基因:AmpC基因)分别采用头孢硝基噻吩显色法、聚合酶链反应(PCR),并运用随机引物扩增PCR(RAPD)与聚类分析对29株产气肠杆菌进行同源性分析。结果 29株β-内酰胺酶阳性的产气肠杆菌中15株超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)编码基因结果阳性,blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-3、blaCTX-M-9基因型分别为2株、1株、6株、4株,1株同时携带blaTEM和blaSHV基因,1株同时携带blaTEM和blaCTX-M-9型基因;12株细菌AmpC酶阳性;5株细菌同时产超广谱ESBLs与ampC酶;29株产气肠杆菌经RAPD与聚类分析,分为11个基因型。结论 ESBLs与AmpC酶是产气肠杆菌所产的2种主要β-内酰胺酶,ESBLs基因型以CTX-M型为主;RAPD分型中Ⅱ型、Ⅲ型为同时产ESBLs与AmpC酶,临床应对这2型产气肠杆菌进行重点监测。     

肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶的基因分型

目的研究西安交通大学医学院第一附属医院临床分离的肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型分布特点。方法收集从临床住院患者中分离的肺炎克雷伯菌83株,ESBLs表型确认试验采用双纸片协同法,ESBLs耐药基因CTX-M、TEM和SHV的检测采用PCR法。结果 83株肺炎克雷伯菌中表型确证实验有76株ESBLs阳性,占91.6%;PCR法检测到携带有耐药基因的菌株41株,CTX-M、SHV和TEM 3种耐药基因的构成比分别为78.1%(32/41)、43.9%(18/41)和34.2%(14/41);在41株产酶菌株中,携带1种基因型的占39.0%(16/41),携带2种基因型的占34.2%(14/41),携带3种基因型的占14.6%(6/41),携带4种基因型的占9.8%(4/41),携带5种基因型的占2.4%(1/41)。结论该院肺炎克雷伯菌ESBLs的基因型主要以CTX-M型和SHV型为主,其基因型分布复杂。     

西安地区肠杆菌科细菌的超广谱β-内酰胺酶基因型的研究

目的测定西安地区肠杆菌科细菌中的超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBL)的基因型。方法在西安市的5所医院中随机选取产ESBL的肠杆菌科细菌25株(共125株),采用PCR方法特异性扩增TEM、SHV和CTX-M型酶的基因片段。结果在125株产ESBL菌中,有33株扩增出TEM型酶基因片段;有27株扩增出特异性SHV型酶基因片段;有49株扩增出特异性的CTX-M型酶基因片段;共有22株细菌同时扩增出两种以上的酶基因片段。结论在西安地区的ESBL肠杆菌科细菌中CTX-M型酶较为流行。     

填埋场快速稳定的功能菌筛选及复合菌系构建

为加速填埋场的稳定化进程,采用传统的微生物学方法,从环境中经反复筛选及多次传代培养得到性能稳定的功能菌.根据功能菌的功能,组合成不同的功能菌群,通过研究各组功能菌群产酶的能力和对填埋场稳定化指标的影响,构建了加速填埋场稳定化进程的复合菌系.结果表明:在性能稳定的功能菌中,含9株纤维素降解菌,8株渗滤液化学需氧量COD(chemical oxygen demand)降解菌,7株絮凝剂产生菌;由所有菌株共同组成的功能菌群Ⅶ#的产酶能力最强,引入填埋场可有效加速填埋垃圾的生物降解,促进填埋场稳定化,使填埋垃圾有机质生物降解率、胡敏酸的百分含量和沉降率较未添加功能菌群对照组分别高26.23%、9.18%和10.01%.     

Carba NP试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用

目的探讨Carba NP试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用。方法收集碳青霉烯类抗生素耐药的51株肠杆菌科细菌,K-B法药敏试验检测常规药物敏感性,E-test法检测试验菌株对碳青霉烯类抗生素的最低抑菌浓度(MIC)值;分别用改良Hodge、Carba NPⅠ试验筛选碳青霉烯酶表型;然后用Carba NPⅡ试验进行碳青霉烯酶表型分类,E-test法测定金属酶,用PCR检测耐药基因。结果 41株Carba NPⅠ试验阳性且经Carba NPⅡ试验证实为产B类金属酶菌株,PCR均证实携带NDM-1基因型。结论 Carba NP试验方便快捷、结果易于判断,与耐药基因检测符合程度高,适合实验室常规开展。     

高效产纤维素酶曲霉生物转化纤维素乙醇

为了提高纤维素乙醇的生产效率,对高效产纤维素酶曲霉W-10的产酶条件进行优化,利用其发酵所得的粗酶液对预处理后的水稻秸秆粉进行酶解,并用酿酒酵母通过同步糖化发酵(simultaneous saccharification and fermentation, SSF)工艺生物转化纤维素乙醇.首先通过定时取样测定还原糖量,研究不同底物浓度、不同表面活性剂添加量、纤维二糖酶的协同作用等因素对酶解过程的影响.然后利用所得优化后的酶解条件进行同步糖化实验,研究不同的发酵温度、发酵时间、初始pH值等影响因素对同步糖化发酵乙醇的影响.结果表明,当底物浓度为80 g/L、表面活性剂吐温-80添加浓度为5 g/L、酶解体系外纤维二糖酶补加量为166.67 nkat/g时,粗酶液的酶解率最高;在35℃的培养温度、初始pH值为5的条件下发酵4 d时,发酵液中乙醇含量最高,乙醇得率可达0.43 g/g(底物干重).优化高效产纤维素酶曲霉W-10酶解水稻秸秆的反应条件,可促进纤维素乙醇生物转化技术的发展,有利于可再生的清洁能源生物乙醇的商业化生产和应用.     

黄芪甲苷通过SIRT1/PGC-1α通路促进退变的髓核细胞增殖

目的探究黄芪甲苷对退变髓核细胞功能的影响及其作用机制。方法原代培养正常与退变髓核细胞并观察,免疫组化检测细胞中胶原蛋白Ⅱ(collagenⅡ)的表达;分别采用20、40、60、80μg/mL的黄芪甲苷处理细胞,通过CCK-8和MTT试剂盒检测细胞活力和增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blotting检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax和沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1(PGC-1α)的表达及其乙酰化和磷酸化水平;比色法检测丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、β-galactosidase和三磷酸腺苷(ATP)的含量。结果与正常髓核细胞相比,退变髓核组织中坏死细胞更多,且collagenⅡ表达降低;细胞经不同浓度黄芪甲苷处理后,40μg/mL黄芪甲苷不仅能显著提高退变髓核细胞活力,促进细胞增殖并抑制其凋亡,而且能上调细胞中SIRT1、PGC-1α的蛋白表达和PGC-1α磷酸化水平,下调PGC-1α乙酰化水平,增加SOD和ATP含量,降低MDA和β-galactosidase含量。结论黄芪甲苷可能通过激活SIRT1/PGC-1α信号通路促进髓核细胞的增殖和存活。     

葡萄球菌的耐药性分析

目的研究医院内葡萄球菌属细菌的耐药状况,为临床合理、有效地使用抗生素提供依据。方法用K-B法对采集的咽拭子标本中分离到的葡萄球菌进行药敏试验,采用双重PCR方法检测葡萄球菌的FemA及MecA基因。FemA和MecA基因均为阳性者为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)菌株,仅MecA基因阳性者为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococci,MRCNS)。结果从采集的361份标本中,分离出葡萄球菌220株,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)110株。住院患者、医护人员葡萄球菌标本中凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative Staphylococci,CNS)分别占84/151(55.63%)、13/25(52.00%),均高于正常人群的13/44(29.55%)(P<0.05);住院患者中的耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus,MRS)对除万古霉素外的常用抗生素均有明显的耐药性。住院患者分离的67株SA中检测到MRSA菌株31株(46.27%);84株CNS中检测到MRCNS菌株26株(30.95%)。结论住院患者标本中的葡萄球菌对常用抗生素均有明显的耐药性,且CNS的比例显著高于正常人群;其中MRS几乎对所有抗生素都表现为耐药,表明MRS已成为医院内感染的重要致病菌。用双重PCR方法检测MRSA,比药敏试验简单,且快速、准确、敏感、特异性强,具有很好的临床应用价值。     

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药性分析及金属β-内酰胺酶的检测

目的 了解我院鲍曼不动杆菌的耐药性及其产金属β-内酰胺酶(MBLs)的情况.方法 采用K-B纸片扩散法测定13种抗菌药物的耐药性;分别用金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和2-巯基丙酸抑制试验测定鲍曼不动杆菌产金属β-内酰胺酶的情况.结果 91株鲍曼不动杆菌中有23株对亚胺培南耐药,其仅对阿米卡星和米诺环素耐药率较低,分别为21.7%和26.1%;对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星部分耐药,耐药率分别为52.2%、43.5%和65.2%;对头孢吡肟耐药率非常高(91.3%);对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、头孢噻肟、头孢他啶、复方磺胺和美罗培南全部耐药;与亚胺培南敏感组比较,除阿米卡星、环丙沙星、米诺环素外,亚胺培南耐药组对其他抗生素的敏感率明显降低、耐药率明显增高(P<0.05).23株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌金属β-内酰胺酶的检出率为65.2%(15/23).结论 耐亚胺培南不动杆菌的耐药现象非常严重,临床应根据药敏结果合理选用抗生素; 金属β-内酰胺酶的产生是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一,实验室应加强对产酶菌株的监测.     

iBAQ非标定量分析生物被膜形成能力不同的鲍曼不动杆菌的蛋白质组学差异

目的利用iBAQ(intensity-based absolute-protein-quantification)非标记定量蛋白质组学分析鉴定生物被膜形成能力不同的鲍曼不动杆菌株蛋白质组学差异。方法 64株临床分离的鲍曼不动杆菌株按生物被膜形成能力不同分为强组和弱组,收集两组菌株蛋白质样本进行FASP(filter-aided sample preparation)酶解,酶解产物进行LC-MS/MS质谱分析。使用Maxquant软件对LC-MS/MS原始文件进行查库以及iBAQ非标定量分析。Maxquant软件查库文件使用Perseus软件分析,通过GO(Gene Ontology)数据库对鉴定出的差异蛋白及特异蛋白从生物学过程、细胞成分和分子功能3方面进行功能注释,通过KAAS(KEGG automatic annotation server)分析差异蛋白涉及的代谢通路。结果实验通过LC-MS/MS分析共鉴定到1 120个肽段,457个蛋白质,其中13个蛋白质的表达在生物被膜形成能力强组和弱组间差异具有统计学意义,其中7个蛋白质在弱组显著性低表达,6个在强组显著性低表达。另外,还鉴定出在生物被膜形成能力弱组(7个)和强组(5个)特异性表达的蛋白质,并对其参与的细胞过程及信号通路进行了分析。结论基于iBAQ的非标记定量蛋白质组学分析方法鉴定出多种与生物被膜形成能力相关的蛋白质,可为分析生物被膜形成的原因、机制及治疗提供参考。     

顽固性慢支患者痰中念珠菌和隐球菌观察

慢性支气管炎患者中,有相当一部分病情重,病程长,反复发作,难于治疗的顽固性病例,其病原与念珠菌和隐球菌是否有关,国内尚少正式报道。为了给这类疾病病原学和防治研究提供科学依据,兹对72例临床上确诊为顽固性慢性支气管炎患者(观察组)和47例年龄、性别等与患者基本相同健康人(对照组)的痰液,按照文中所述方法,进行分离培养与鉴定。以期对这一问题的初步阐明,获得一定的科学实验资料。实验结果表明,强致病力的白色念珠菌、两种念珠菌混合感染和新型隐球菌分离阳性率,患者明显高于健康人(P<0.005)。且持续时间长,难于阴转。     

肝移植术后重症监护病房细菌感染的临床研究

目的分析肝移植术后重症监护病房(ICU)细菌感染的流行病学资料及抗菌药物敏感性,为临床有效预防和控制感染,减少耐药菌株提供依据。方法回顾性分析2000年11月至2004年6月我院肝移植术后ICU患者病原学资料及其对抗菌药物的敏感性。结果肝移植ICU细菌感染率高,病原菌多为多重耐药菌,其中革兰阴性菌(G-菌)占47.2%,革兰阳性菌(G+菌)占33.6%,真菌占19.2%。G-菌中以产酸克雷伯菌、不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌以及大肠埃希氏菌为主,对亚胺培南、左旋氧氟沙星最为敏感;G+菌以葡萄球菌属和肠球菌属为主,尤其是肠球菌属明显增多,对万古霉素、丁胺卡那霉素最为敏感。结论加强肝移植术后ICU的细菌分离及耐药性监测非常重要。依据病原学及抗菌药物敏感性资料合理选择抗菌药物控制感染,有助于减少新的耐药菌株的出现。     

综合重症监护病房患者呼吸机相关性肺炎的病原学和耐药性分析

目的探讨病原菌在综合重症监护病房(ICU)患者呼吸机相关性肺炎(VAP)中的分布及对常用抗生素的耐药情况。方法对我院2004-2006年综合ICU患者VAP病原菌的分布及耐药性进行回顾性统计分析。结果从302例综合ICU VAP患者下呼吸道深部分泌物标本中分离出347株病原菌,主要病原菌是铜绿假单胞菌(32.3%)、鲍曼不动杆菌(31.1%)、金黄色葡萄球菌(16.7%)、克雷伯菌(7.5%)与凝固酶阴性葡萄球菌(6.1%)。革兰阴性杆菌(G-杆菌)对哌拉西林、头孢噻肟耐药率最高,对碳青霉烯类及加酶抑制剂抗生素耐药率最低;革兰阳性球菌(G 球菌)对青霉素类、克林霉素及红霉素耐药率高,对万古霉素、喹诺酮类抗生素耐药率低。结论G-杆菌是综合ICU患者VAP最主要的病原菌,多重耐药性高;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MR-SCNS)的分离率高且耐药严重。临床医师应根据病原菌学及抗菌药物敏感性资料,及时选择合理的抗生素控制感染,延缓耐药菌株的产生。     

陕西病区粮食真菌及其毒素在克山病、大骨节病病因中作用的比较研究

目的　克山病 (KSD)和大骨节病 (KBD)两病病因至今尚未明了 ,特调查病区粮食真菌及其毒素在两病病因中的作用。方法　用病例对照研究结合实验病理学验证以探索粮食内可疑致病真菌及其相关毒素质量与两病发病的关系。结果　① 40 2份小麦内培养出的优势菌为链格孢霉 ,其检出率与两病发病之间未见统计学联系 ,未培养出镰刀菌 ;② 2 4份小麦和 2 3份小麦面粉样品内未检出 1 1种镰刀菌毒素中的任一毒素 ,1 4 3份小麦、玉米样品内未检出AOH、AME和ZEN ;③化学纯品T 2毒素 (1 0 0 μg·kg- 1BW·d)致雏鸡KBD模型实验和链格孢霉培养粮 (含AOH 6 5 1 9μg/ g饲料 )致雏鸡KSD、KBD模型实验 ,均未见动物心肌损害和软骨损害等 ;④T 2毒素和MON实验组内 ,检出小型猪关节软骨OC—Ⅲ型损害 ,后一结果对KBD病因研究的参考价值需待更多工作之后才好判定。结论　病例对照研究和实验病理学综合结果不支持两病病因镰刀菌毒素中毒说和链格孢霉毒素中毒说。建议多家协作 ,重复粮食真菌及其毒素的检测 ,以便对两病真菌毒素病因说作出最终评价。     

真菌密度感应分子Farnesol在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用

目的探讨真菌密度感应分子Farnesol在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用。方法将表皮葡萄球菌标准株ATCC35984及白假丝酵母菌标准株ATCC10231混合培养建立体外生物膜模型,加入Farnesol或不加入Farnesol分为Farnesol处理组和对照组,孵育2、4、6、8、12、24、48、72、96h时用结晶紫染色法半定量检测生物膜形成能力;二甲氧唑黄(XTT)比色法评价生物膜的体外生长动力学;扫描电子显微镜观察生物膜超微结构;荧光定量PCR分析各组生物膜形成相关基因的表达情况。结果结晶紫染色法生物膜半定量检测显示,12、24hFarnesol处理组和对照组差异有统计学意义(P<0.05)。XTT比色法生长动力学检测显示,Farnesol处理组在4、48h与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜结果显示,对照组混合生物膜结构较Farnesol处理组致密复杂。荧光定量PCR结果显示,培养6hFarnesol处理组表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因icaA、fbe、aap基因及白假丝酵母菌生物膜形成相关基因als3、hwp1、efg1基因的表达下调;培养24hFarnesol处理组表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因aap基因及白假丝酵母菌生物膜形成相关基因als3、hwp1、efg1基因的表达下调。结论在真菌密度感应分子Farnesol的干预下,对照组形成的混合生物膜较Farnesol处理组结构更为致密及复杂,这种结构的改变可能与Farnesol处理组白假丝酵母菌生物膜形成相关基因als3、hwp1、efg1基因的表达下调相关性更密切。     

DON毒素和硒对软骨聚集蛋白聚糖硫酸化修饰的影响

目的研究大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)可疑致病因子脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和补硒对软骨细胞外基质聚集蛋白聚糖(aggrecan)硫酸化修饰的影响。方法应用体外单层培养C28/I2人软骨细胞,采用MTT法测定不同浓度DON和不同作用时间下的细胞增殖活性,通过Real-time PCR和Western-blot法分别检测加DON毒素或补硒后软骨细胞的aggrecan、PAPS合成酶2(PAPS synthetase 2,PAPSS2)、PAPS转运体1(PAPS transporter 1,PAPST1)、N-乙酰氨基半乳糖胺-4,6-硫酸转移酶[carbohydrate(N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O)sulfotransferases 15,CHST15]以及芳基硫酸酯酶B(arylsulfatase B,ARSB)mRNA和蛋白的表达水平。结果 DON毒素可抑制C28/I2软骨细胞系的增殖活性,在DON毒素作用下aggrecan、PAPSS2、PAPST1和CHST15的mRNA和蛋白质表达水平降低,ARSB mRNA和蛋白质表达水平升高,加硒可在一定程度上改善这种状况。结论 DON毒素对软骨细胞的增殖有明显的抑制作用,细胞对毒素有一浓度和时间的依赖性;DON毒素可通过改变aggrecan硫酸化修饰相关酶类的表达水平影响软骨蛋白聚糖的硫酸化。     

尿路感染细胞实验中庆大霉素对尿路致病大肠杆菌的杀伤作用及细胞毒性研究

目的 在尿路感染体外细胞实验中,比较不同浓度庆大霉素(0、10、20、50、100、200μg/mL)对尿路致病大肠杆菌(UPEC)的杀伤作用,对尿路上皮细胞及炎性细胞如巨噬细胞的毒性作用。方法 比较不同浓度庆大霉素对不同量UPEC J96菌株(10⁸、10⁷、10⁶)的杀伤情况;CCK-8实验检测不同浓度庆大霉素在不同时间内(2 h或24 h)对原代培养的C57BL/6雄鼠肾小管上皮细胞、腹腔巨噬细胞、人膀胱上皮细胞系J82的毒性作用;根据实验选择合适的庆大霉素浓度和作用时间,检测J96对小鼠肾小管上皮细胞的黏附、入侵以及小鼠巨噬细胞对J96的吞噬、清除作用。结果 庆大霉素(≥10μg/mL)对J96的杀伤作用均强于1%的青霉素/链霉素双抗(P<0.000 1),高浓度庆大霉素(≥100μg/mL)可在30 min内完全杀伤高达10⁸的J96。50μg/mL庆大霉素作用2 h可对人膀胱上皮细胞系J82产生毒性作用(P<0.05)。结论 本文明确了不同细胞体外实验时适宜的庆大霉素处理浓度...