西安地区肠杆菌科细菌的超广谱β-内酰胺酶基因型的研究

目的测定西安地区肠杆菌科细菌中的超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBL)的基因型。方法在西安市的5所医院中随机选取产ESBL的肠杆菌科细菌25株(共125株),采用PCR方法特异性扩增TEM、SHV和CTX-M型酶的基因片段。结果在125株产ESBL菌中,有33株扩增出TEM型酶基因片段;有27株扩增出特异性SHV型酶基因片段;有49株扩增出特异性的CTX-M型酶基因片段;共有22株细菌同时扩增出两种以上的酶基因片段。结论在西安地区的ESBL肠杆菌科细菌中CTX-M型酶较为流行。     

RD-PCR技术在酵母基因表达谱研究中的应用

目的　应用RD PCR技术分离酵母基因。方法　首先提取酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)总RNA ,纯化mRNA ;然后 ,反转录成双链cDNA ;再用限制性内切酶Sau3AI酶切 ,在酶切片段上加上接头后 ,用通用引物U进行第一次PCR扩增 ,以这一产物为模板用选择性引物(在通用引物的 3’端延伸两个碱基 )作第二次PCR扩增。 5 %PAGE胶分离基因片段 ,选择单带割胶回收 ,做第三次PCR扩增 ,与载体连接 ,最后进行测序分析。结果　采用这种方法分离得到的基因片段 ,经Blast检索分析 ,确为来自酿酒酵母基因的cDNA片段或表达序列标签 (EST)。结论　RD PCR技术可以有效地分离EST ,可用于酵母基因表达调控的研究。     

腹腔外科感染的抗生素疗法

腹腔外科感染病人,抗生素疗法占有重要地位。252例腹腔脓液普通培养,24.2%无菌生长。培养出的菌丛中,绝大多数为革兰氏阴性细菌,大肠艾希氏菌占32.5%。选用抗生素应考虑:①菌丛及其联合存在的多样性;②药物进入胆汁的量与速度;③血与组织中的浓度;④药物的抗菌谱,毒性和价格。     

临床致病性不动杆菌的分子生物学鉴定

目的对临床致病性不动杆菌进行种属鉴定,并比较3种方法(44℃生长试验、特异性引物PCR扩增和16SrRNA测序)对鲍曼不动杆菌鉴定的特异性、准确性及应用价值。方法收集临床致病不动杆菌56株,首先接种在胰蛋白胨大豆肉汤中44℃进行培养,观察是否可以生长;其次,提取56株不动杆菌基因组DNA,用两组不同的特异性引物进行PCR扩增鉴定;最后,用通用引物对56株不动杆菌的16SrRNA进行测序鉴定。结果 56株不动杆菌中有17株可在44℃生长。经特异性引物PCR扩增鉴定,发现8株鲍曼不动杆菌和3株13TU型不动杆菌均可在44℃中较早较快生长。金标准16SrRNA测序确定56株不动杆菌中含有9个种,其中鲍曼不动杆菌和13TU型不动杆菌的鉴定结果与特异性引物PCR扩增法相同。结论应用分子生物学方法鉴定鲍曼不动杆菌具有准确、高效且可重复性高的优点,尤其是特异性PCR扩增法,可作为较难诊断的鲍曼不动杆菌的首选鉴定方法。     

转移人端粒酶逆转录酶基因的实验研究

目的　转移人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT基因 ) ,建立其转移体系。方法　用脂质体转染的方法将逆转录病毒载体PLNC hTERT转入 ψ 2细胞 ,用产病毒的 ψ 2细胞克隆培养上清重复感染PA317细胞 ,建立产毒PA317/hTERT细胞 ;通过感染内皮细胞检测基因转移效果。结果　ψ 2细胞培养上清重复感染 ,使PA317细胞所产病毒滴度提高 2 0倍 ,得到高滴度的PA317/hTERT包装细胞系。用该细胞系产生的病毒上清感染内皮细胞成功。结论　可通过重复感染法建立高效的逆转录病毒基因转移系统     

基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测

目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌(310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2,并将PCR产物测序;提取CRISPR database数据库中(标准法)100株肠道细菌(47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2序列。使用CRISPR Finder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPR database数据库的CRISPR序列。Clustal X软件进行间隔序列比对。比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性。结果共分析543株肠道细菌,其中75.6%的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5%志贺菌、91.7%沙门菌和95%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1,其间隔序列数目为3~26、2~9、2~32、3。57.1%的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6%志贺菌、85.4%沙门菌和100%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2,其间隔序列数目为1~20、1~6、2~27、1或4个。95%的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90%CRISPR2分别含有3条独特间隔序列(S1-1,S1-2,S1-3)和1条独特间隔序列(S2-1)。间隔序列比对结果显示,S1-1+S1-2+S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100%和99.6%。标准法检测和PCR扩增CRISPR1和CRISPR2检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性分别达99.6%和99.3%。基于CRISPR检测大肠埃希菌O157∶H7在模拟样品中的应用,结果显示在原样品大肠埃希菌O157∶H7浓度约2.3CFU/mL时,经12h增菌后即能检测出来。大肠埃希菌O157∶H7聚类分析显示,40株O157∶H7大肠埃希菌可分为3类。结论基于CRISPR的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法,可以作为监测大肠埃希菌O157∶H7感染和高毒株大肠埃希菌O157∶H7有价值的流行病学工具。     

激光显微切割联合功能分类表达谱芯片技术在脑缺血研究中的应用

目的探讨激光捕获显微切割分离大鼠脑微血管和神经元联合功能分类表达谱cDNA芯片技术在脑缺血研究的应用。方法激光捕获显微切割获取脑切片微血管和神经元,微量RNA提取试剂盒提取总RNA,线性扩增mRNA,紫外分光光度计定量所得aRNA(antisense RNA)扩增效率,基因特异性引物进行cDNA探针合成,进行芯片杂交反应。结果微血管和神经元各自捕获的总点数大约为8000~10000,T7线性扩增所得aRNA的量约为500~1000ng,探针合成效率高,杂交反应格局清晰良好。结论激光捕获显微切割,结合T7RNA线性扩增及基因特异性引物线性扩增技术,可成功的应用于功能分类表达谱cDNA芯片的分析研究。     

散发性帕金森病α—synuclein基因突变的检测

目的 探讨α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因右突变与散发性帕金森病人的关系。方法 分离ＰＤ组和对照组的外围血基因组ＤＮＡ，采用α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｘ基因特异引物对其第四外显子进行ＰＣＲ扩增，扩增产物用Ｔｓｐ４５Ⅰ酶切鉴定。结果 两组ＰＣＲ均可扩增出２１６ｂｐ的片段，ＰＣＲ产物不能被Ｔｓｐ４５Ⅰ酶切。结论α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因已知点突变与散发性帕金森病可能无明确关系。     

聚合酶链反应法测定7种抗生素耐药基因

目的　建立快速检测非培养感染物中抗生素耐药基因表达的分子生物学方法 ,为临床的早期诊断和治疗及研究微生物学耐药机制提供一种理想的分子生物学技术。方法　应用聚合酶链反应测定 7种抗生素耐药基因 ,并通过优化测定体系中镁离子浓度、引物浓度及引物退火温度等 ,对PCR反应方法进行了质控。结果　 7种抗生素耐药基因扩增条带清晰 ,无非特异性扩增条带 ,与所设计的扩增片段大小相符。结论　应用PCR检测微生物的耐药基因 ,灵敏度高 ,特异性强。可简便、快速地检测细菌、真菌、衣原体和支原体的耐药基因 ,尤其联合检验对临床早期诊断、治疗及鉴定耐药菌株及亚型具有一定价值。     

肝移植术后重症监护病房细菌感染的临床研究

目的分析肝移植术后重症监护病房(ICU)细菌感染的流行病学资料及抗菌药物敏感性,为临床有效预防和控制感染,减少耐药菌株提供依据。方法回顾性分析2000年11月至2004年6月我院肝移植术后ICU患者病原学资料及其对抗菌药物的敏感性。结果肝移植ICU细菌感染率高,病原菌多为多重耐药菌,其中革兰阴性菌(G-菌)占47.2%,革兰阳性菌(G+菌)占33.6%,真菌占19.2%。G-菌中以产酸克雷伯菌、不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌以及大肠埃希氏菌为主,对亚胺培南、左旋氧氟沙星最为敏感;G+菌以葡萄球菌属和肠球菌属为主,尤其是肠球菌属明显增多,对万古霉素、丁胺卡那霉素最为敏感。结论加强肝移植术后ICU的细菌分离及耐药性监测非常重要。依据病原学及抗菌药物敏感性资料合理选择抗菌药物控制感染,有助于减少新的耐药菌株的出现。     

人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆

目的　扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因 ,将其克隆到T载体来构建T载体文库。方法　收集乳腺癌患者外周转移淋巴结 30例 ,TRIzol法提取总RNA、纯化mRNA ,行RT PCR扩增 ,制备T载体 ,用于PCR产物的克隆。结果　总RNA纯度高 ,完整性好 ,mRNA获得率为 1%。经RT PCR ,VH、Vλ、Vκ的每一条 5 '端引物均与其相应的 3'端引物成功地扩增出了可变区基因片段 ,轻、重链T载体库分别为 1.7× 10 8和 3.5× 10 8。结论　所采用的引物能够10 0 %扩增目的片段 ,T载体过渡能显著提高克隆效率 ,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。     

孕妇外周血PCR技术用于胎儿产前性别诊断的可靠性分析

采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术，以Ｙ染色体特异重复序列Ｙ１．１、Ｙ１．２和ＳＲＹ基因编码区Ｐ１、Ｐ２为引物，分析了用孕妇外周血进行胎儿性别诊断的可靠性，并与绒毛样本进行了对比。结果表明：用孕妇外周血时，Ｙ１．１，Ｙ１．２引物的诊断符合率为７５％；Ｐ１、Ｐ２引物不能扩增出Ｙ特异ＤＮＡ序列。而用绒毛样本时，两种引物的诊断符合率均为１００％。结果提示：孕妇外周血ＰＣＲ技术用于胎儿性别诊断尚有待改进，而采用绒毛样本进行胎儿性别诊断更为可靠。     

STR位点基因扫描在亲子鉴定中的应用

目的　探索一种易于标准化的亲子鉴定方法。方法　选用九个群体家系资料明确的四核苷酸重复的STR位点 ,用荧光标记物标记引物、PCR复合扩增、灵敏度更高的 3 77测序仪对 45例亲子鉴定案例进行电泳分型 ,并自动收集数据和分析 ,自动判定STR位点等位基因和基因型。结果　 2 1个案例排除亲子关系 ,2 4例不排除亲子关系。结论　STR位点的基因扫描方法简便、省时、快速 ,灵敏度高 ,结果准确可靠     

多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗的构建及其表达效率

目的构建多房棘球绦虫(Em)重组双歧杆菌(Bb)-Em14-3-3疫苗,并研究Em14-3-3分子在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法通过PCR扩增Em14-3-3抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Em14-3-3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗。经PCR和酶切鉴定后以IPTG诱导表达Em14-3-3/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR成功扩增出530 bp的Em14-3-3基因;双酶切证实Em14-3-3基因插入pGEX-1λT中;PCR证实重组Bb-Em14-3-3疫苗构建成功;SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了Em14-3-3/GST融合蛋白,表达效率为23%。结论成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗,重组质粒pGEX-Em14-3-3在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot结果提示表达出的Em14-3-3重组蛋白具有特异抗原性。     

产不同β-内酰胺酶产气肠杆菌基因型及同源性分析

目的了解医院感染产气肠杆菌产β-内酰胺酶的基因型情况,并对其同源性进行分析。方法β-内酰胺酶试验与基因型检测(包括4个超广谱β-内酰胺酶基因:blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-3、blaCTX-M-9基因与1个AmpC酶基因:AmpC基因)分别采用头孢硝基噻吩显色法、聚合酶链反应(PCR),并运用随机引物扩增PCR(RAPD)与聚类分析对29株产气肠杆菌进行同源性分析。结果 29株β-内酰胺酶阳性的产气肠杆菌中15株超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)编码基因结果阳性,blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-3、blaCTX-M-9基因型分别为2株、1株、6株、4株,1株同时携带blaTEM和blaSHV基因,1株同时携带blaTEM和blaCTX-M-9型基因;12株细菌AmpC酶阳性;5株细菌同时产超广谱ESBLs与ampC酶;29株产气肠杆菌经RAPD与聚类分析,分为11个基因型。结论 ESBLs与AmpC酶是产气肠杆菌所产的2种主要β-内酰胺酶,ESBLs基因型以CTX-M型为主;RAPD分型中Ⅱ型、Ⅲ型为同时产ESBLs与AmpC酶,临床应对这2型产气肠杆菌进行重点监测。     

Graves病自身免疫单链抗体库的构建及抗甲状腺单抗的筛选

目的　Graves病属于甲状腺自身免疫性疾病 (AITD) ,其患者血中存在多种抗甲状腺自身抗体 ,其中包括TGAb、TPOAb以及TRAb。单链抗体 (ScFv)是以连接肽将重链可变区基因 (VH)和轻链可变区基因 (VL)连接起来形成的单链小分子抗体。为了获得人源性抗甲状腺抗体 ,分析其基因结构 ,进一步研究AITD的发病机理 ,我们构建了人源性噬菌体ScFv库。方法　采取Graves病人静脉血 ,用淋巴细胞分层液按常规分离单个核细胞。提取淋巴细胞总RNA逆转录合成cDNA。分别扩增出全套的免疫球蛋白VL 链和VH 链基因 ,利用重叠PCR方法 ,构建ScFv基因。重组到 p3SCMH嗜菌粒中 ,电穿孔转化XL1 Blue大肠杆菌。经适当培养后 ,加入约 10 12 空斑形成单位 (PFU)的辅助噬菌体VCSM13,构建噬菌体抗体库。测定库容 ,鉴定重组率。以固相化的抗原对噬菌体ScFv库进行了 4轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,富集特异性噬菌体抗体。用ELISA竞争抑制实验检测富集的噬菌体抗体。结果　以单链cDNA为模板 ,用PCR方法分别扩增VL 链和VH 链的DNA。PCR产物经 15g·L-1琼脂糖电泳检测 ,分别在 380bp和 4 2 0bp左右见到扩增带。将VL 和VH 进行重叠PCR制备ScFv ,琼脂糖电泳显示PCR产物在 80 0bp左右有扩增带。将ScFv基因纯化 ,用SacⅠ+SpeⅠ双酶消化后 ,重组到 p3     

pcDNA3.1(+)/caveolin-1真核表达质粒的构建及其在MCF-7乳腺癌细胞株中的表达

目的明确正常组织和人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1的表达情况,构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1表达质粒,并鉴定其表达。方法 RT-PCR法检测9种正常人体组织及人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1基因的扩增情况;Western blotting法检测MCF-7细胞中caveolin-1蛋白的表达情况。设计克隆引物和表达引物,RT-PCR法扩增caveolin-1基因,用EcoRⅠ+XbaⅠ内切酶消化回收PCR产物和质粒pcDNA3.1(+),连接后构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒。挑选pcDNA3.1(+)/caveolin-1转染感受态细菌后的单菌落进行PCR鉴定,阳性菌落培养后提取质粒行酶切鉴定及测序鉴定。瞬时转染MCF-7细胞后Western blotting检测caveolin-1蛋白的表达情况。结果①9种正常组织中均有caveolin-1基因扩增,MCF-7细胞中无caveolin-1基因扩增且无蛋白表达;②pcD-NA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒转染MCF-7细胞后caveolin-1蛋白表达良好。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒,瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞后caveolin-1表达稳定。     

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列与毒力基因和耐药基因的关系

目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比对等方法获得志贺菌中CRISPR1、CRISPR2和CRISPR-Q1的分布情况、重复序列和间隔序列信息,通过BLAST方法获得毒力基因和耐药基因在志贺菌中的分布情况,SPSS 21.0软件分析CRISPR与毒力基因和耐药基因的关系。结果志贺菌中的CRISPR1和CRISPR2在不同菌株中的间隔序列差别较大,CRISPRQ1分布更为广泛(超过99%)。毒力基因在志贺菌中分布比较广泛(均超过56%),耐药基因中的blaOXA-1、camr、Sul2、tetB分布也比较广(超过50%)。CRISPR1/CRISPR2与是否携带9种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05),CRISPR-Q1与是否携带3种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2和CRISPR-Q1均与志贺菌中存在的毒力基因和耐药基因的个数间有统计学关联(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目之间存在统计学关联(χ2=61.6,P<0.001)。结论志贺菌中不同CRISPR的分布差异比较大,存在的间隔序列数目不等;志贺菌CRISPR与部分毒力基因和耐药基因之间存在负相关;CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目存在正相关。     

人类OPRM1-EXON1的克隆与探针的制备

目的　克隆、测序人类 OPRM1- EXON1,并用非同位素 生物素标记法对该基因进行标记、制备探针,用于OPRM1- EXON1的表达及功能研究。方法　通过PCR法扩增目的基因片段,并将其连接到pGEM- T载体上,转入感受态细胞中进行重组并克隆,经酶切和基因测序进行鉴定,用非同位素 生物素标记法进行探针的标记与制备。结果　经过PCR扩增的目的基因片段大小(2.2 kb)与理论上片段大小一致,经过测序证实其序列与 NCBI提供的序列相同,用此片段成功的制备了用于研究阿片受体基因的探针。结论　从基因组中成功克隆了人类 OPRM1- EX ON1,并制备了探针,为深入研究吗啡依赖相关基因及基因表达创造了必要的条件。     

宫颈癌组织表皮生长因子受体对TKI敏感性相关的基因突变研究

目的研究宫颈癌组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因中是否存在与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)药物敏感性相关的18、19及21外显子突变,为本地区宫颈癌的靶向治疗提供依据。方法收集70例宫颈癌患者的新鲜癌组织标本,提取DNA,以特异性引物PCR扩增EGFR基因外显子18、19及21,进行DNA测序并分析序列相似性。结果 70例宫颈癌组织提取质量良好的DNA中,均未检测到EGFR基因18、19及21外显子突变。结论宫颈癌组织EGFR基因外显子18、19及21突变罕见。