雄黄治疗维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病-M_3及诱导凋亡的作用

目的　研究雄黄体外诱导人急性早幼粒细胞白血病 M3细胞凋亡的作用 ,并观察其对维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病 M3的治疗效果。方法　用雄黄处理在体外培养耐维甲酸的人白血病细胞 ,电子显微镜观测白血病细胞凋亡过程 ,并前后对照观察应用雄黄治疗维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病 M3的疗效。结果　在 1 .0～ 2 .0 μmol·L- 1 的浓度下 ,雄黄作用于白血病细胞 2 4h后 ,可见到较为典型的细胞凋亡形态学变化 :细胞核固缩 ,染色体凝集 ,呈新月型紧贴于核膜周边 ,核碎裂 ,染色质片断化 ,凋亡小体形成等。用雄黄治疗的 2 0例患者 ,完全缓解(CR) 1 7例 ,部分缓解 (PR) 1例 ,总有效率 (CR +PR) 90 %。结论　雄黄能够诱导耐维甲酸的白血病细胞凋亡 ,可用于维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病 M3治疗 ,且缓解率及长期生存率高。     

硫化砷对MR2细胞组织因子表达的影响

目的　探讨硫化砷 (雄黄As4S4,雌黄As2 S3 )对MR2细胞 (维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞株 )促凝活性 (PCA)和组织因子 (TF)表达的影响。方法　用 30 0 μg·L-1As4S4与 2 μmol·L-1As2 S3 分别与MR2细胞共同孵育 6、12、2 4、4 8、72h ,用复钙时间、ELISA法、半定量RT PCR检测未处理及两种硫化砷处理后的MR2细胞的促凝活性、组织因子抗原表达及组织因子mRNA转录的变化 ,同时检测未处理的NB4、HL 6 0、K5 6 2细胞的促凝活性、组织因子抗原表达作为对照。结果　As4S4和As2 S3 均呈时间依赖方式下调MR2细胞的促凝活性、组织因子抗原的表达及其mRNA的转录。As4S4的下调作用比As2 S3 的作用更明显。结论　下调MR2细胞组织因子的表达并降低其促凝活性可能是硫化砷改善急性早幼粒细胞白血病 (APL)患者弥散性血管内凝血 (DIC)早期出血症状的主要机制之一     

人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究

目的 探讨并优化人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定;诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,为其进一步应用奠定基础.方法 用酶消化法分离培养hUCMSCs,通过传代培养、扩增,倒置光学显微镜及原子力显微镜下观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖曲线,流式细胞仪检测免疫表型;体外向成骨、脂肪方向诱导分化,并通过特异性染色鉴定其分化能力.结果 采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs.接种24h,贴壁细胞形态多为长梭型、多边形或成纤维细胞样形态,大小均一.P3、P7代细胞的生长曲线基本一致,增殖能力强.流式细胞仪分析,第3代细胞强烈表达CD29、CD44、CD105,不表达CD34、CD45和HLA-DR.经成骨诱导分化后4周,碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节;经成脂诱导3周,油红O染色呈阳性,有明显的脂滴出现.结论 本实验建立了一套体外稳定培养扩增hUCMSCs的方法.所培养的细胞成分单一、扩增迅速、生物学形状稳定,并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,有望成为组织工程较为理想的种子细胞.     

新型肿瘤靶向纳米颗粒联合光动力治疗对人宫颈癌Hela细胞的体外杀伤作用

目的探讨新型肿瘤靶向纳米颗粒R11-SSPEI/miR-145联合光动力疗法对人宫颈癌Hela细胞的体外杀伤作用及可能的机制。方法 MTT检测R11-SSPEI/miR-145联合光动力疗法对Hela细胞的毒性作用;克隆形成实验检测细胞增殖状态;Annexin V-PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡;JC-1染色后流式细胞仪检测线粒体膜电位及凋亡情况。DCFH-DA染色后用荧光显微镜及Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)水平。Western blot检测Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、BIP的蛋白表达。流式细胞仪及MTT检测ROS抑制剂NAC作用于联合治疗组后Hela细胞内变化。结果 R11-SSPEI/miR-145可被Hela细胞高摄取。MTT结果显示R11-SSPEI/miR-145联合光动力疗法可显著抑制宫颈癌Hela细胞生长。克隆形成实验发现联合治疗组细胞增殖抑制作用显著高于空白对照组、单纯药物治疗组及单纯光照组(P=0.031)。Annexin V-PI双染后发现联合治疗可显著提高Hela细胞凋亡(P=0.014);JC-1荧光染色后发现联合治疗组细胞膜电位显著下降(P=0.023)。Western blot发现Bcl-2蛋白表达显著降低,而Caspase-3、Caspase-9、BIP表达显著增高(P<0.05)。联合治疗组ROS水平显著升高,且可被NAC抑制。NAC可部分挽救联合治疗引起的细胞凋亡。结论新型肿瘤靶向纳米颗粒R11-SSPEI/miR-145联合光动力疗法对Hela细胞具有良好的杀伤效应,增敏机制可能与R11-SSPEI/miR-145诱导大量自由基产生及内质网凋亡,进而启动凋亡基因程序有关。     

氧化砷治疗恶性血液病和肿瘤的研究进展

三氧化二砷是中药传统毒药 ,近年来 ,国内外学者应用其治疗以急性早幼粒细胞白血病为主的恶性血液病和某些实体瘤 (如肝癌、结肠癌等 ) ,疗效显著。体内外研究发现其主要细胞学和分子学机理涉及到 :①诱导细胞凋亡和促进部分分化 ;②降解某些特异性融合蛋白 ;③下调Bcl 2的表达 ;④下调线粒体跨膜电位△Ψm ;⑤活化半胱氨酸蛋白酶Caspases等作用。目前对氧化砷治疗后复发的防治、砷剂对细胞传导信号的影响等问题的研究正在进行中。     

miRNA-449家族靶向CCNE2对胃癌细胞生长的抑制调节作用

目的研究miRNA-449在胃癌细胞中对细胞增殖、凋亡的影响,以及对靶基因CCNE2(cyclin E2)表达的影响。方法荧光定量PCR检测人低分化胃癌细胞株BGC823瞬时转染miRNA-449a/b及抑制剂后的表达;流式细胞术分析转染后细胞凋亡变化。Western blot检测miRNA-449a/b对靶基因表达的影响。结果在转染后,miRNA-449a/b组在48、72h对肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用(P<0.05),miRNA-449a/b组对肿瘤细胞凋亡有明显的促进作用(P<0.05),对CCNE2蛋白表达有显著抑制作用(P<0.05)。结论 miRNA-449a/b可能通过CCNE2来发挥其抑制胃癌细胞生长的作用。     

舒芬太尼抑制肝癌Hep3B细胞活性及促进凋亡作用

目的探讨舒芬太尼对肝癌Hep3B细胞活性的影响及相关机制。方法以Hep3B肝癌细胞为研究对象,经不同浓度(0.01、0.1、1、5、10、15μmol/L)舒芬太尼处理后,MTT法观察细胞活性的改变,流式细胞仪及AnnexinV/PI双标记染色检测Hep3B细胞周期及凋亡的变化,Western blot检测survivin及caspase-3蛋白的表达。结果随着舒芬太尼浓度的增加,肝癌细胞活性降低,细胞周期停滞在G0/G1期,细胞凋亡增多,survivin蛋白表达量降低,caspase-3蛋白表达量升高。结论舒芬太尼能通过改变肝癌细胞的细胞周期,促进细胞凋亡,改变survivin和caspase-3蛋白的表达,抑制Hep3B细胞的活性。     

人骨髓间充质干细胞生物学特性及腺病毒介导的GFP标记

目的建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分离、培养以及鉴定的方法,同时应用腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)检测细胞转染的效率。方法应用人淋巴细胞分离液(Ficoll)对hMSCs进行分离,经贴壁纯化后用MTT法检测增殖能力;并对其成骨、成脂、成平滑肌诱导分别进行碱性磷酸酶(ALP)、油红O染色及α-SMA免疫细胞化学检测;采用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面标志的表达。用Ad-GFP转染,并应用荧光显微镜与FCM检测转染效率。结果 hMSCs镜下为成纤维样形态,约在第4天进入对数增长期;分化诱导后ALP染色、Von kossa银染、油红O染色以及α-SMA均为阳性;FCM检测CD14、CD31、CD45表达阴性,CD44、CD73、CD106及PDGFRβ表达阳性;当感染复数MOI=200,细胞培养48h时感染效率较高,FCM检测显示为99.81%。结论经过对增殖、分化能力以及表面标志的分析,证明用Ficoll可以分离得到较纯的hMSCs,Ad-GFP可以很好地感染细胞,为组织工程种子细胞的体内示踪提供了途径。     

长链非编码RNA-p21诱导脑动脉粥样硬化血管平滑肌细胞凋亡

目的探究长链非编码RNA-p21(lncRNA-p21)通过调控脑平滑肌细胞凋亡,参与脑动脉粥样硬化发生发展的机制。方法选取贵阳市第二人民医院健康体检者和脑血管动脉粥样硬化患者各30例,实时荧光定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)检测患者血清lncRNA-p21的含量。建立大鼠脑动脉粥样硬化模型,HE染色观察大鼠脑组织病理改变,RT-PCR检测脑组织lncRNA-p21含量,Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax以及mTOR的表达。用ox-LDL刺激人脑血管平滑肌细胞(BVSMCs)构建血管平滑肌细胞动脉粥样硬化模型,过表达或抑制lncRNA-p21,流式细胞仪和TUNEL检测细胞凋亡情况。Caspase-3活性检测试剂盒检测凋亡蛋白Caspase-3的表达活性。结果脑动脉粥样硬化患者血清和模型组大鼠脑组织lncRNA-p21表达显著下降(P<0.05);HE染色结果显示模型组大鼠脑组织损伤明显,lncRNA-p21减少(P<0.05);同时伴有Caspase-3活性升高,Bcl-2、mTOR蛋白表达下降且Bax蛋白表达升高(P<0.05);在细胞试验中,流式细胞仪和TUNEL结果显示过表达lncRNA-p21可以降低BVSMCs的凋亡,抑制lncRNA-p21促进BVSMCs的凋亡(P<0.05);脑血管平滑肌细胞中过表达lncRNA-p21,Caspase-3活性降低,Bcl-2、mTOR蛋白表达升高且Bax蛋白表达降低(P<0.05);抑制表达lncRNA-p21,Caspase-3活性增加,Bcl-2、mTOR蛋白表达降低且Bax蛋白表达升高(P<0.05)。结论 lncRNA-p21可能通过调控mTOR蛋白表达来调控脑血管平滑肌细胞凋亡,参与脑动脉粥样硬化的病理过程。     

全反式维甲酸与奥沙利铂在诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡中的协同作用

目的 观察全反式维甲酸(ATRA)与奥沙利铂(L-OHP)对人胃癌BGC-823细胞增殖的影响.方法 分别用ATRA和L-OHP单独及联合作用于人胃癌BGC-823细胞,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,倒置显微镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期;免疫细胞化学技术检测BGC-823细胞中Bcl-2和Survivin蛋白的表达情况.结果 ATRA作用后BGC-823细胞的增殖受到抑制,细胞形态发生了改变,凋亡比例明显增加;与L-OHP联用后,该作用加强.胃癌 BGC-823细胞中Bcl-2和Survivin蛋白的表达在ATRA作用后均受到抑制,ATRA与L-OHP联合作用后蛋白表达的阳性率进一步降低.结论 ATRA能抑制人胃癌BGC-823细胞的生长,与L-OHP联用具有协同抑制作用,其机制可能与下调Bcl-2和Survivin蛋白表达有关.     

Hypoxia-induced enhancement of cell invasiveness in SMMC7721 hepatocellular carcinoma cells

Objective To explore the effects of hypoxia (1% O2) on the ability of cell invasiveness and expression of KAI1/CD82 in SMMC7721 hepatocellular carcinoma cells. Methods SMMC7721 hepatocellular carcinoma cells were cultured by hypoxia ( 1% O2) in vitro, and the ability of cell invasiveness was analyzed by cell invasion assay.Immunohistochemistry staining technique was used to evaluate the protein expression of KAI1/CD82. Results Cell invasion assay revealed that hypoxia enhanced the ability of invasiveness of hepatocellular carcinoma cells. In addition,KAI1/CD82 protein expression was positive in cultured SMMC7721 hepatocellular carcinoma cells, and it was located diffusedly in the cytoplasm and on the membrane. KAI1/CD82 protein expression was down-regulated when mediated by hypoxia; at the same time, it showed a time-effect relationship. Conclusion Hypoxia can enhance invasiveness of hepatocellular carcinoma cells. The down-regulation of KAI1/CD82 expression may play a certain role in those courses.     

鸦胆子油脂质体对人肝癌细胞株HepG2抑制作用的体内外研究

目的通过体外体内实验探讨鸦胆子油脂质体对人肝癌细胞株HepG2的影响及可能机制。方法利用鸦胆子油脂质体高剂量(5mg/L)、低剂量(2.5mg/L)体外作用于人肝癌细胞株HepG2,MTT比色分析法分析HepG2细胞生长抑制程度,流式细胞仪检测不同药物浓度作用下细胞的凋亡率,透射电镜下观察HepG2细胞形态变化。通过腹腔注射荷瘤裸鼠进行体内试验,观察鸦胆子油脂质体小剂量(12.5mg/L)、大剂量(25mg/L)对其肝脏的病理改变;TUNEL法检测肝脏肿瘤组织凋亡细胞。结果 MTT比色分析法实验结果显示鸦胆子油脂质体可明显抑制HepG2细胞增殖;透射电镜下观察5mg/L鸦胆子油脂质体在体外作用于HepG2细胞6h后,可见明显凋亡细胞形态出现。流式细胞仪检测随鸦胆子油脂质体作用强度和时间的增加,细胞抑制率逐步由33.31%提升至90.62%(P<0.01)。鸦胆子油脂质体腹腔注射组较阴性对照组动物模型死亡时平均体重增加,肿瘤转移率下降(P<0.01);TUNEL法亦提示鸦胆子油脂质体组凋亡细胞率增加(P<0.01)。结论鸦胆子油脂质体对HepG2细胞在体内体外具有抑制增殖的作用,并可诱导肿瘤细胞凋亡。     

宫颈癌细胞凋亡及Fas、FasL基因的表达

目的　检测宫颈癌中Fas、FasL的表达和宫颈癌细胞凋亡。方法　采用免疫组织化学SP法对 47例宫颈癌、1 6例宫颈上皮内瘤样变 (CIN)、1 0例慢性宫颈炎及 1 0例正常宫颈中Fas和FasL的表达进行检测 ;并采用TUNEL技术 ,对 47例宫颈癌细胞凋亡进行原位观察。结果　Fas和FasL在宫颈癌中表达与CIN、慢性宫颈炎及正常宫颈有显著性差异 (P <0 0 1 ) ,并且与宫颈癌细胞的分化程度有关 ;宫颈癌细胞凋亡与癌细胞分化程度、临床分期有关 (P <0 0 5 )。Fas和FasL表达阳性的宫颈癌细胞凋亡均高于Fas和FasL阴性组 (P <0 0 5 )。结论　Fas及FasL对宫颈癌细胞凋亡具有促进作用。基因治疗特异性改变凋亡阈限有利于改变宫颈癌的自然进程。     

柴胡皂甙d对肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

目的观察柴胡皂甙d(SSd)对肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响及其作用机制。方法肝癌SMMC-7721细胞株经内毒素(脂多糖,LPS)诱导,加入不同质量浓度的SSd作用后,MTT比色法检测细胞增殖抑制率,光学、电子显微镜和流式细胞仪观察细胞凋亡,放免法检测细胞前列腺素E2(PGE2)产生量。结果SSd对肝癌细胞增殖有明显的抑制作用,并呈剂量和时间依赖性。镜下观察,SSd作用组细胞可见典型凋亡小体形成,细胞凋亡率达17.5%。肿瘤细胞前列腺素E2的产生量,SSd作用组明显下降,接近环氧合酶2(COX-2)抑制剂尼美舒利(Nimesulide)作用组水平。结论SSd可能通过下调COX-2的表达,抑制PGE2产生而发挥抗癌作用。     

人宫颈癌细胞凋亡的研究

目的　观察顺铂、60 Co在宫颈癌细胞凋亡的作用及其引起的细胞形态学、DNA及细胞周期变化。方法　将人宫颈癌细胞株Hela,SiHa和RJC进行体外培养 ,用不同强度的放射线60 Co照射 ,观察照射后不同时间内肿瘤细胞形态变化 ,并采用末端脱氧核苷酰转移酶标记法 (TDT法 )检查细胞DNA有无断裂 ,用流式细胞仪记录细胞周期的改变和Bcl 2蛋白表达情况。同时将顺铂处理的宫颈癌细胞作为对照组 ,观察放射线和药物对宫颈癌细胞的联合作用。结果　经60 Co照射的三株细胞均出现凋亡的典型形态学改变 ,TDT法染色见受照细胞核内均有DNA断裂表现 ;细胞周期进展受到阻滞 ;Bcl 2蛋白表达在Hela细胞升高 ,而在SiHa和RJC细胞则降低 ,SiHa细胞对60 Co照射最为敏感 ,40 0CGy即可出现细胞凋亡的改变。顺铂单独处理可使宫颈癌细胞凋亡 ,与放射线联用有明显的增强细胞凋亡的效果。并在RJC细胞的G1 峰前出现凋亡峰。结论　宫颈癌细胞受到60 Co照射后 ,凋亡是其主要死亡形式 ,不同的宫颈癌细胞株对放射线的敏感性存在明显差异 ,与细胞凋亡有关的Bcl 2表达与宫颈癌细胞凋亡的发生呈负相关 ,放射线照射与化疗药物联合可以增加抑制宫颈癌生长的作用。     

TGF-β1对成人骨髓CD105~+间充质干细胞增殖与分化的影响

目的分离并鉴定成人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),研究TGFβ1对骨髓MSCs增殖与分化的影响。方法分离成人骨髓单个核细胞;MACS磁珠分选CD105+细胞;FACS检测其免疫表型;诱导分选的CD105+细胞向脂肪及成骨细胞分化,油红O染色、VonKossa染色及RTPCR检测脂肪细胞及成骨细胞;观察TGFβ1对分选出的CD105+细胞分化与增殖的影响;免疫荧光染色检测诱导后的脂肪细胞CD105的表达情况;MTT法检测TGFβ1对CD105+细胞增殖的影响。结果成人骨髓来源的CD105+细胞体外可向脂肪及成骨细胞分化;在向脂肪细胞分化过程中,加入1～50ng/mLTGFβ1后,成脂诱导体系中无脂肪细胞出现;在向成骨诱导过程中,加入20ng/mLTGFβ1后,钙化基质沉淀明显降低;在脂肪诱导体系中,MTT染色检测显示TGFβ1对CD105+细胞的增殖有明显促进作用(P<0.05)。结论TGFβ1抑制成人骨髓源CD105+MSCs向脂肪及成骨细胞分化,在向脂肪诱导过程中,TGFβ1促进MSCs的增殖。     

siRNA directed against TrkA sensitizes human pancreatic cancer cells to apoptosis induced by gemcitabine through an inactivation of PI3K/Akt-dependent pathway

Pancreatic cancer is a lethal disease.Despite sig-nificant advances in diagnosis,staging,and surgicalmanagement of the disease,less than10%of pa-tients survive for more than one year fromthe ti meof diagnosis[1-2].The largely refractory response tochemotherapy is a common feature of this disease,and eventhe principal therapeutic agent,the nucleo-side analogue gemcitabine(2′,2′-difluorodeoxycyt-idine),only marginally affects clinical outcomes[3].Therefore,further understanding of the chemores…     

EFFECTS OF ANTISENSE OLIGODEOXYNUCLEOTIDES ON EXPRESSION OF CASPASE-3 IN Γ-RADIATION INDUCED APOPTOTIC HL-60 CELLS

Objective To study the inhibitory effects of caspase-3 mRNA antisense oligodeoxynucleotides (ASODN) on expressions of caspase-3 and it's mRNA in γ-radiation induced apoptotic HL-60 cells, and screen the effective ASODN. Methods ASODN-1 and ASODN-2 targeting 5′-noncoding region and initial translation region of caspase-3 mRNA were respectively designed, synthesized and introduced into HL-60 cells by means of liposome-mediated transfection followed by 10Gy γ-radiation exposures. TUNEL assay was conducted to investigate the morphologic change and apoptotic percentage of HL-60 cells 18 h later. Immunocytochemical staining and one step RT-PCR were respectively performed to detect the expressions of caspase-3 and it's mRNA. Mismatched oligodeoxynucleotide (MODN) transfected and un-transfected HL-60 cells were taken as control. Results TUNEL assay found that the apoptotic percentages in ASODN-1 and ASODN-2 groups were significantly reduced compared with the control groups (P<0.01) when the final concentration of both ASODNs was ≥3μmol/L. Immunocytochemistry showed that caspase-3 positive cell percentages were reduced but the average gray values increased significantly compared with the control groups (P<0.01). RT-PCR showed expressions of caspase-3 mRNA was decreased after ASODN transfection. Furthermore, ASODN-1 proved more effective in inhibiting HL-60 cell apoptosis than ASODN-2 (P<0.01). Conclusion Caspase-3 mRNA ASODNs can prevent HL-60 cells from apoptosis induced by γ-radiation and reduce expression of caspase-3 and its mRNA. These effects are dose dependent in a certain range.