慢性HBV感染者外周血单个核细胞干扰素-γ的表达及其影响因素

目的探讨慢性乙肝病毒(HBV)感染者干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平及其影响因素。方法采用实时定量RT-PCR技术和ELISA法分别检测慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中IFN-γmRNA的表达和血清IFN-γ的分泌水平;巢式PCR技术检测PBMCs中HBV DNA。结果慢性HBV感染者IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于对照组(P<0.01,P<0.05);慢性HBV携带者IFN-γ的表达和分泌水平均显著低于HBeAg阳性组(P均<0.05)和HBeAg阴性组(P均<0.01);HBeAg阳性组IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于HBeAg阴性组(P均<0.01);PBMCs中HBV DNA阳性组IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于HBV DNA阴性组(P均<0.01);IFN-γ表达和分泌水平与血清HBV DNA水平均呈负相关(P均<0.01)。结论慢性HBV感染者IFN-γ低表达;高病毒载量可抑制IFN-γ的表达。     

基于GEO数据库筛选慢性乙型病毒性肝炎患者对干扰素α治疗无应答相关的关键免疫基因和通路

目的 基于GEO数据库筛选接受干扰素α(IFN-α)治疗的慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者中应答者（Rs）和无应答者（NRs）之间差异表达的免疫基因,以探索IFN-α治疗CHB失败的分子基础。方法 从GEO数据库中下载基因芯片数据集GSE27555,包含6例Rs和7例NRs。使用R软件筛选Rs和NRs肝脏组织的差异表达基因,再从免疫相关基因数据库ImmPort下载包含1 793个基因在内的标志性免疫基因集,提取差异表达基因中的免疫基因,获取差异免疫基因。再对差异免疫基因进行基因本体论(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析。通过STRING在线分析工具构建差异免疫基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络,进一步利用Cytoscape软件中的Cytohubba插件对差异免疫基因按Degree、MCC、MNC、Closeness算法计算评分位于前10的基因,再取交集,得到枢纽基因（Hub基因）。结果 从Rs与NRs间共筛选出差异免疫基因88个,其中上调基因13个,下调基因...     

CD25分子胞外段基因免疫应答中B淋巴细胞的变化及意义

目的 用鼠CD25分子胞外段基因疫苗免疫Balb/c小鼠,观察其诱导的体液免疫应答中B淋巴细胞的变化并探讨其意义.方法 用pcDNA3.1-CD25胞外段真核表达质粒分别在第0天、第10天和第20天肌肉注射免疫同系Balb/c小鼠,酶联免疫法(ELISA)检测抗CD25胞外段的抗体水平及亚型,FACS检测脾细胞中B淋巴细胞的比例变化及细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的表达变化.结果 与对照组相比,CD25胞外段基因免疫组小鼠血清抗CD25抗体在免疫后逐渐升高,第30天达最高峰;抗CD25抗体主要以IgG1为主;免疫小鼠脾细胞中B细胞的比例变化不显著(P>0.05),但高分泌IL-4和IL-10(P<0.05),而低分泌IFN-γ(P<0.05).结论 CD25胞外段蛋白基因免疫中B细胞功能变化显著,这为后续深入研究体液免疫应答在T细胞疫苗中的作用提供了前期实验基础.     

更年期大鼠Th1/Th2平衡与脾细胞凋亡

目的了解更年期大鼠脾细胞凋亡与辅助性T细胞1(T-helper l,Th1)和辅助性T细胞2(T-helper 2,Th2)型细胞因子的增龄性改变。方法应用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪测定脾细胞凋亡率;ELISA法测血清γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)水平。结果更年期组大鼠脾细胞凋亡率(10.3%vs.7.7%,P<0.05)、血清IFN-γ质量浓度明显高于年轻组大鼠(23.80 ng/Lvs.10.92 ng/L,P<0.01);更年期组大鼠与年轻组相比血清IL-4质量浓度有下降趋势,但差别无显著意义(0.1296 ng/Lvs.0.3094 ng/L,P>0.05);更年期组血清IFN-γ/IL-4比值明显高于年轻组(183.64vs.35.29,P<0.01),Th1/Th2平衡朝Th1漂移。结论大鼠衰老过程中Th1/Th2平衡朝Th1漂移,脾细胞凋亡增加与IFN-γ水平增高有关。     

胃癌细胞株SGC-7901及MGC-803中SURVIVIN基因转录与表达的鉴定

目的　探讨胃腺癌细胞株SGC 790 1及MGC 80 3中survivin基因转录与表达情况 ,为胃癌与survivin基因的相关研究提供帮助。方法　①利用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)及DNA序列测定技术检测两种细胞株中survivin基因mRNA转录情况。②采用免疫组织化学染色鉴定两种细胞株survivin基因有无蛋白表达及其表达程度。结果　从提取的胃癌细胞总RNA中扩增出 6 12bp的DNA片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ;序列测定显示两细胞株的DNA扩增片段序列与基因库survivin基因mRNA序列完全一致 ;免疫组织化学染色显示两细胞株中均有survivin蛋白表达产物。结论　中国人胃腺癌细胞株SGC 790 1及MGC 80 3中均存在survivin基因的mRNA转录及蛋白的高表达     

结核多表位DNA疫苗免疫效果及其对小鼠耐药结核病的疗效观察

目的研究比较结核分枝杆菌Hsp70、Ag85A、ESAT-6多表位DNA疫苗和卡介苗(BCG)的免疫效果,观察该疫苗联合抗结核药物治疗耐药结核病小鼠的疗效。方法随机将BALB/c小鼠分成A、B、C组,分别用PBS、BCG和多表位DNA疫苗经皮下免疫,1、3、5周各免疫1次。免疫后眼球采血,分离血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法测定特异性IgG抗体,用ELISA双抗体夹心法测定IL2和IFN-γ;同时分离小鼠脾细胞,用MTT法测定淋巴细胞增殖指数。为观察多表位疫苗的疗效,小鼠尾静脉注射结核分枝杆菌双耐菌株(耐利福平和耐异烟肼),4周后将感染模型小鼠随机分成D、E、F 3组,其中D组为阴性对照,注射生理盐水;E组用利福平、异烟肼治疗;F组为联合用药组,用结核分枝杆菌Hsp70、Ag85A、ESAT-6多表位DNA疫苗和利福平、异烟肼联合治疗,疗程均为10周。治疗结束后称取小鼠体重,取其肺、肝、脾,称取质量,并作肺和脾脏菌落计数。结果多表位DNA疫苗组小鼠血清特异性IgG抗体、IL2、IFN-γ和淋巴细胞增殖指数均明显高于PBS组和BCG组(P<0.05);多表位DNA疫苗联合抗结核化疗药能明显降低耐药结核病小鼠肺、脾菌落计数和肺、肝和脾脏指数(P<0.05)。结论结核分枝杆菌Hsp70、Ag85A、ESAT-6多表位DNA疫苗能在小鼠体内诱导较强的特异性免疫反应,产生高水平的特异性IgG抗体、诱导IL2和IFN-γ分泌和特异性淋巴细胞增殖,并能显著提高抗结核药物对耐药结核病小鼠的疗效。     

阿德福韦酯对慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ、IL-10、乙型肝炎病毒DNA水平及肝组织病理的影响

目的观察阿德福韦酯(ADV)对慢性乙型肝炎患者血清细胞因子IFN-γ、IL-10、乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)水平及肝组织病理的影响。方法采用ELISA法检测18例慢性乙肝患者治疗前及治疗48周后血清细胞因子IL-10、IFN-γ的水平;治疗前后血清HBV DNA检测采用实时荧光定量PCR法;同时对治疗前后肝穿组织行常规病理染色。结果治疗前血清细胞因子IFN-γ、IL-10水平均较正常对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗48周后血清细胞因子IFN-γ、IL-10水平较治疗前均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后与正常对照组比较,IFN-γ水平仍低,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后IL-10水平略低,与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗48周后丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平及血清HBV DNA载量均较治疗前明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05),其血清HBV DNA转阴率达72.22%。治疗后肝组织炎症活动度较治疗前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);肝组织纤维化程度较治疗前有所改善,但差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前肝组织炎症活动度明显组(G≥3级)与炎症活动度低组(G≤2级)经治疗后观察,前组IFN-γ水平升高更明显,差异有统计学意义(P<0.05);前组血清HBV DNA转阴率达88.89%,后组达55.56%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ADV可能改善慢性乙肝患者血清细胞因子IFN-γ、IL-10水平失衡,有助于慢性乙型肝炎病毒感染者免疫力的恢复,特别是治疗前肝组织炎症明显的患者治疗效果可能更好。     

超滤膜提取当归补血汤对荷瘤小鼠脾细胞IL-2和IFN-γ的诱生作用

目的 观察超滤膜提取当归补血汤对荷瘤小鼠脾细胞白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-7)的诱生作用,探讨其对荷瘤小鼠免疫系统的调节机制.方法 采用超滤膜分离技术提取当归补血汤,用双抗体夹心ELISA法检测培养脾淋巴细胞上清液中IL-2和IFN-γ的含量,用反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定脾淋巴细胞IL-2和IFN-γmRNA的表达水平.结果 超滤膜提取当归补血汤各剂量组小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IL-2和IFN一γ的含量均较模型组增高,大剂量组与模型组比较有显著性差异(P＜O.05).各剂量组小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN一γ mRNA的表达水平均增高,中剂量组和大剂量组与模型组比较,均有显著性差异(P＜O.05).结论 超滤膜提取当归补血汤能够促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌及其mRNA的表达,从而发挥免疫调节作用.     

依曲替酸对寻常型银屑病皮肤IFN-γ、IL-4 mRNA表达的影响

目的 探讨依曲替酸治疗寻常型银屑病(psoriatic vulgaris, PV)的作用机制.方法 观察依曲替酸对30例PV患者的临床疗效,并用原位杂交技术对患者治疗前后皮损中Th1型细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4)mRNA进行检测.结果 依曲替酸能改善PV患者病情,有效率76.67%.IFN-γ、IL-4 mRNA主要在真皮表皮交界处的淋巴细胞胞质中表达,IFN-γ mRNA的表达治疗前(45.61±9.96)明显高于正常对照(4.40±1.20,P<0.01),治疗后(16.82±7.20)明显下降(P<0.01).IL-4 mRNA表达无显著变化.结论 依曲替酸治疗PV的作用机制可能与其抑制皮肤中IFN-γ mRNA的表达及调节Th平衡有关.     

IFN一γ对MMP-2、-9和TIMP-1在HL-60细胞中表达的影响

目的 研究白血病细胞株HL-60中基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)和基质金属蛋白酶天然抑制剂-1(TIMp-1)的表达及细胞因子干扰素(IFN-γ)对MMP-2、MMP-9和TIMP-1转录水平的调节.方法 分别在HL-60细胞生长的不同时期(1-5d)收集细胞,采用半定量RT-PCR方法 ,分析白血病细胞株HL-60中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达水平;以不同浓度的IFN-γ作用于HL-60细胞,24、48 h后RT-PCR检测MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA水平的变化.结果 细胞接种后24 h MMP-2和MMP-9的mRNA水平最高,但TIMP-1表达相对恒定.IFN-γ各个浓度组对MMP-2和MMP-9 mRNA表达均有抑制作用(P＜0.05),且随着作用浓度的增高mRNA表达减少;TIMP-1对其调节不敏感.结论 明确了白血病HL-60细胞株在转录水平表达MMP-2、MMP-9和TIMP一1;IFN-γ对MMP-2、MMP-9 mRNA表达有明显的抑制作用,而对TIMP-1转录无明显作用.     

白细胞介素-2协同白细胞介素-18活化自然杀伤细胞活性的作用

目的研究白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-18(IL-18)诱导自然杀伤(NK)细胞活化和抗骨髓瘤细胞活性的协同作用。方法流式细胞仪方法检测NK细胞表面CD69的表达;阴性细胞纯化法用于获得高纯度的NK细胞;ELISA测定NK细胞培养上清液中干扰素(IFN-γ)的浓度;标准铬51释放试验评估NK细胞杀伤骨髓瘤细胞的能力。结果与单一应用IL-18相比,低浓度IL-2和IL-18联合应用显著提高了NK细胞的活性、分泌干扰素(IFN-γ)的水平和杀伤骨髓瘤细胞的作用。结论低浓度IL-2具有协同IL-18活化NK细胞抗骨髓瘤细胞的作用,此结果为IL-2和IL-18联合应用治疗骨髓瘤奠定了一定的理论基础。     

SLE患者外周血单个核细胞分泌IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ水平及意义

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中Th1/Th2偏移现象。方法采用外周血单个核细胞(PBMC)培养和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测37例SLE患者和17例健康人外周血单个核细胞(PBMC)培养上清液中IL-4I、L-10I、L-12和干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果SLE患者的IL-10水平高于健康对照组(P<0.05);IL-12低于健康对照组(P<0.01);IL-4和IFN-γ与健康对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结论SLE患者外周血Th1/Th2细胞平衡失调,IL-10升高,IL-12下降。     

胃癌细胞株SGC—790l及MGC—803中SURVIVIN基因转录与表达的鉴定

目的 探讨胃腺癌细胞株SGC-7901及MGC-803中survivin基因转录与表达情况，为胃癌与survivin基因的相关研究提供帮助。方法 ①利用反转录聚合酶链反应(RT—PCR)及DNA序列测定技术检测两种细胞株中survivin基因mRNA转录情况。②采用免疫组织化学染色鉴定两种细胞株survivin基因有无蛋白表达及其表达程度。结果 从提取的胃癌细胞总RNA中扩增出612bp的DNA片段，与预期的扩增片段大小相符；序列测定显示两细胞株的DNA扩增片段序列与基因库survivin基因mRNA序列完全一致；免疫组织化学染色显示两细胞株中均有survivin蛋白表达产物。结论 中国人胃腺癌细胞株SGC-7901及MGC-803中均存在survivin基因的mRNA转录及蛋白的高表达。     

参芪注射液对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的细胞免疫机制

目的研究参芪注射液的体内抑瘤效应与荷瘤机体细胞免疫功能的关系,探讨其抑瘤作用的细胞免疫学机制。方法建立小鼠H22肝癌实体瘤模型,分别给予高、中、低剂量参芪注射液,测定各组小鼠肿瘤生长抑制率(IR)和腹腔巨噬细胞的吞噬指数;采用MTT法测定各组小鼠脾淋巴细胞增殖指数;ELISA法检测各组小鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)水平。结果高、中剂量参芪注射液实验组小鼠H22实体瘤IR分别为60.72%和48.65%,与模型组比较有显著性差异(P<0.05);参芪注射液实验组小鼠脾脏淋巴细胞增值指数、腹腔巨嗜细胞吞噬指数、血清IL-2和IFN-γ的含量都显著高于模型组小鼠(P<0.05)。结论参芪注射液通过提高荷瘤小鼠的细胞免疫功能,改善荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫状态,协同对肿瘤细胞的直接杀伤作用,在荷瘤小鼠体内发挥其抑瘤抗瘤作用。     

USP39抑制肿瘤细胞放射敏感性的机制

目的探讨泛素特异性肽酶39(ubiquitin-specific peptidase 39, USP39)对肿瘤细胞DNA损伤应答通路的生物学作用。方法将不同肿瘤细胞系(293T, HeLa, U2OS, T47D)分别在含有100 mL/L FBS的DMEM或RPMI-1640培养基中,在37℃含有50 mL/L CO_2的培养箱中培养;用MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium, inner salt]方法检测敲低USP39对肿瘤细胞放射敏感性的影响;流式细胞术检测同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复效率;Western blot检测敲低USP39对DNA损伤应答相关分子的表达情况;用免疫共沉淀、蛋白纯化及质谱技术,检测与USP39相互作用的蛋白并且进行基因本体论(gene ontology, GO)分析;通过微辐射诱导DNA损伤并利用激光共聚焦显微镜检测其募集至DNA损伤位点的情况。结果敲低USP39导致肿瘤细胞的放射敏感性显著增加(P<0.05);敲低USP39显著抑制肿瘤细胞的HR与NHEJ修复效率(P<0.05);敲低USP39能够促进DNA损伤应答因子蛋白的表达;USP39能够聚集至DNA损伤位点;USP39相互作用蛋白与多个DNA损伤应答相关的信号通路有关。结论 USP39对DNA损伤应答过程具有重要作用。     

射频热凝靶点消融减压术对腰椎间盘突出症患者血清TNF-α、IFN-γ和IL-17水平的影响

目的探讨射频热凝靶点消融减压术对腰椎间盘突出症患者血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素17(IL-17)水平的影响。方法收集2010年1月至2015年12月在西安交通大学第一附属医院康复医学科入院治疗的腰椎间盘突出症患者276例为试验组,均进行射频热凝靶点消融减压术;选取同期健康体检者133例为对照组。收集住院患者的一般资料和手术前后的血清及对照组血清,ELISA法检测TNF-α、IFN-γ和IL-17水平的变化。结果腰椎间盘突出症患者血清TNF-α、IFN-γ和IL-17水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);与手术前比较,射频热凝靶点消融减压术后恢复期血清TNF-α、IFN-γ和IL-17水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论射频热凝靶点消融减压术治疗腰椎间盘突出症不仅能够改善患者疼痛症状,而且能够减轻患者全身炎症反应,值得临床推广应用。     

幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

原发性肾病综合征患儿白细胞介素-4、γ-干扰素与激素疗效的关系

目的探讨原发性肾病综合征患儿治疗前外周血白细胞介素-4(IL-4)、γ-干扰素(IFN-γ)与激素治疗效应的关系。方法31例原发性肾病综合征患儿于治疗前抽取静脉血分离单个核细胞,加入植物血凝素刺激其生长,取其上清液,用酶联免疫吸附双抗夹心法检测IL-4、IFN-γ,激素治疗8周后根据治疗反应分为激素敏感组(17例)及激素耐药组(14例)。20例健康儿童作为对照组。结果原发性肾病综合征中激素敏感组治疗前外周血IL-4水平明显高于激素耐药组(P<0.01);IFN-γ水平在激素敏感组及激素耐药组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论测定肾病综合征患儿治疗前外周血中的IL-4可以作为预测激素疗效的一项指标。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)14-3-3重组蛋白的免疫保护力

目的探讨细粒棘球蚴Eg14-3-3重组蛋白的免疫保护性及其伴随的免疫反应。方法 ICR小鼠随机分为rEg14-3-3蛋白免疫组和PBS佐剂对照组,每隔2周背部皮下免疫1次,连续免疫3次。在第3次免疫后6周,用细粒棘球蚴活的原头蚴进行攻击感染,感染后24周杀鼠取脾,分离培养脾细胞,MTT检测淋巴细胞增殖率,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-4水平,同时检获棘球蚴包囊数并计算减囊率,用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平。结果与佐剂对照组比较,rEg14-3-3蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为84.47%,rEg14-3-3蛋白免疫组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a抗体水平高于对照组(P<0.05);IgE略低,但两组间差异无统计学意义;淋巴细胞增殖实验结果显示rEg14-3-3免疫组小鼠脾淋巴细胞特异抗原刺激后增殖显著,免疫组淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2分泌水平显著高于对照组,而IL-4、IL-10在两组间差异无统计学意义。结论 rEg14-3-3蛋白能诱导小鼠产生高水平的免疫保护力,是潜在的疫苗候选抗原分子。     

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定

目的 克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2(UBC E2)全长编码序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做充分准备.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBC E2基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,并使用Western blotting分析其免疫反应性.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-UBC E2构建成功,该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达,十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL-21/DE3得到高效表达,亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明其有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫UBC E2可在原核表达系统中表达,并具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能奠定基础.