抗哇巴因多克隆抗体的制备及免疫周期和剂量的研究

制备抗哇巴因多克隆抗体 ,探讨最佳的免疫周期及免疫剂量。应用哇巴因 (ouabain) -牛血清白蛋白 (BSA)结合物为抗原免疫家兔 ,每周从兔耳缘静脉采血 ,监测哇巴因特异抗体的产生 ;以0 .2 5mg/次、1mg/次、1.75mg/次、2 mg/次四种不同免疫剂量进行最佳免疫剂量的研究。 5个月后颈动脉取血 ,进行抗体效价、亲和力及特异性的检测。结果显示免疫间隔为 6周、免疫剂量为 1.75mg/次时可以获得高效价、高亲和力和高特异性的哇巴因抗血清。     

哇巴因抗体制备的方法学研究

目的　探索合适的实验条件 ,制备高度特异性以及高效价的哇巴因抗体 ,促进国内对内源性哇巴因这种皮质类固醇激素的研究。方法　利用外源性哇巴因分别与牛血清白蛋白 (BSA)及卵清蛋白 (OVA)耦联 ,制备抗原免疫家兔 ,根据对兔免疫后动物体内抗体效价连续监测的结果来制定免疫方案 ,制备哇巴因抗血清 ,分别应用硫酸铵分段盐析法和DEAE D52 纤维素阴离子非保留色谱相配伍的方法纯化哇巴因抗体 ,并对该抗体进行特异性、亲和性及纯度测定。结果　所得抗体效价最高达 1∶(1× 1 0 6) ,亲和常数最高为 1 .59× 1 0 8,除了与地高辛存在 9.2 0 %～1 9.80 %的交叉结合反应外 ,与结构类似的其他几种物质 ,如强的松、安体舒通、西地兰、睾酮及地塞米松的交叉结合率均小于 5% ,SDS PAGE结果显示所得抗体为电泳纯。结论　应用本研究中所探索出的实验方法 ,获得了高特异性、高亲和性以及高效价的哇巴因抗体 ,可用于对内源性哇巴因的临床与实验研究。     

抗哇巴因多克隆抗体F(ab)2 片段的研制及鉴定

目的用胃蛋白酶酶解抗哇巴因多克隆抗体,制备出片段,为改型抗体的研究提 供依据。方法免疫家兔制备出抗哇巴因多克隆抗体,并用胃蛋白酶分别在不同的酶解条件下消化抗体,继之用高效液相排阻色谱法(HPSEC)对其进行分析、纯化,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测、鉴定其活性。结果用胃蛋白酶2mg／100mg抗哇巴因多克隆抗体,消化18h,反应体系的pH3.0时,可获得片段。结论用胃蛋白酶酶解抗哇巴因多克隆抗体是研制出有活性的片段的有效方法。     

抗哇巴因多克隆抗体F(ab)2 片段的研制及鉴定

目的　用胃蛋白酶酶解抗哇巴因多克隆抗体 ,制备出F(ab) 2 片段 ,为改型抗体的研究提供依据。方法　免疫家兔制备出抗哇巴因多克隆抗体 ,并用胃蛋白酶分别在不同的酶解条件下消化抗体 ,继之用高效液相排阻色谱法 (HPSEC)对其进行分析、纯化 ,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测、鉴定其活性。结果　用胃蛋白酶 2mg/1 0 0mg抗哇巴因多克隆抗体 ,消化 1 8h ,反应体系的 pH3 0时 ,可获得F(ab) 2 片段。结论　用胃蛋白酶酶解抗哇巴因多克隆抗体是研制出有活性的F(ab) 2 片段的有效方法     

葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在筛选致敏蛋白组分的应用

目的制备、鉴定兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体,并初步应用于葎草花粉致敏蛋白组分的筛选。方法用葎草花粉变应原浸液免疫兔,获得高效价抗葎草花粉蛋白抗血清,应用琼脂免疫双扩散、ELISA法以及Western blotting鉴定产生的抗体。同时对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行Western blotting检测。结果兔抗血清效价经ELISA检测,效价>1∶10000,免疫双扩散结果表明抗血清只与葎草花粉变应原形成特异性IgG沉淀线,Western blotting检测兔抗血清IgG可以特异性识别葎草花粉8种蛋白组分,分子质量分别为100、88、76、69、65、55、49、38 ku,患者血清IgG可以识别5种蛋白组分,分子质量分别为100、76、55、493、8 ku。结论制备的兔抗血清具有较高效价和较好的特异性,应用该血清筛选出的葎草花粉致敏蛋白组分与患者血清筛选的组分相似,因此可进一步应用于初筛cDNA表达文库。     

正常SD大鼠血清及组织内源性哇巴因的含量及其意义

探讨正常 SD大鼠血清及组织内源性哇巴因 ( EO)的含量 ,为 EO生理及病理作用的进一步研究提供理论及实验依据。方法　制备高度特异性的哇巴因抗体 ,应用酶联免疫吸附试验 ( ELISA)的方法 ,对正常 SD大鼠血清及组织标本测定其 EO含量。结果　血清、肝脏、肾脏、肾上腺、垂体及下丘脑内 EO含量分别为 ( 1 .1 2± 0 .1 7) μg/ L、( 1 .79± 0 .44) μg/ kg组织、( 1 .0 8±0 .63)μg/ kg组织、( 1 .73± 0 .81 )μg/ kg组织、( 2 7.54± 6.91 )μg/ kg组织、( 1 .83± 0 .54)μg/ kg组织、( 1 0 .1 0± 3.0 8) μg/ kg组织。肾上腺内 EO含量明显高于其它组织及血清 EO含量。结论　确定了正常 SD大鼠血清及多种组织内源性哇巴因的含量 ,提示肾上腺有可能是 EO的主要来源     

表皮生长因子受体Ⅲ型变异体（EGFRvⅢ）多克隆抗体的制备及特异性

为了制备针对EGFRvⅢ的特异性多克隆抗体,在实验中利用耦联了血蓝蛋白的EGFRvⅢ特异性的PEP3合成短肽进行动物免疫,制备抗血清;构建了pET30a／E33XI原核表达载体,表达和纯化了融合蛋白His-E33（EGFRvⅢ的部分胞外区）;以此融合蛋白作为抗原制备了抗体纯化柱,通过柱上纯化的方法从抗血清中提取针对EGFRvⅢ的特异性抗体．利用U87、U251、HeLa和HEK-293细胞进行免疫组化实验来检验抗体的特异性．     

嗜铬细胞瘤组织中内源性哇巴因表达的意义

目的　探讨内源性哇巴因 (EO)在肾上腺嗜铬细胞瘤组织中表达的意义。方法　采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白 过氧化酶连接法 (SP法 )检测EO在嗜铬细胞瘤组织中的表达。结果　血压与EO在嗜铬细胞瘤组织中的表达呈现相关关系。伴有血压升高的嗜铬细胞瘤患者 ,其瘤组织中EO呈弥漫性强阳性表达 ;而EO在不伴有血压升高的嗜铬细胞瘤患者则呈现阴性表达。结论　EO与嗜铬细胞瘤所致的高血压关系密切 ,为其进一步研究提供了有价值的形态学依据。     

抗鸭乙肝病毒core蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗鸭乙肝病毒core蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。方法 PCR扩增鸭乙肝病毒(DHBV)core基因片段,构建表达载体pET28a(+)/DHBV core。转化诱导表达融合蛋白,用Ni 2+亲和柱纯化目的蛋白。免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选,采用有限稀释法筛选单克隆杂交瘤细胞并进行细胞克隆。体内诱生法大量制备单克隆抗体,进行抗体的特异性、效价和亚型的鉴定。结果成功构建表达载体pET28a(+)/DHBV core,并表达DHBV core蛋白。获得2株稳定分泌抗DHBV core抗体的杂交瘤细胞株,分别为2D7和5G10,细胞培养液抗体效价为1∶400和1∶800。选择5G10细胞株制备单克隆抗体,小鼠腹水抗体效价可达1∶320 000。鸭肝组织免疫组化结果显示,DHBV病毒载量>1010copies/mg的肝组织中DHBV core蛋白的表达明显高于病毒载量<105copies/mg的肝组织,而未感染DHBV的鸭肝细胞内不表达DHBV core蛋白。亚型鉴定结果为IgG2aκ链。结论制备并获得了抗DHBV core蛋白的单克隆抗体,为DHBV core蛋白的功能研究、诊断试剂的研制与抗病毒治疗研究奠定了基础。     

复方锁阳口服液对小鼠性激素水平及免疫功能的影响

目的 观察复方锁阳口服液对小鼠性激素水平的影响及其对免疫功能的调节作用,探讨其临床疗效机制.方法 用复方锁阳口服液大(180mg/kg)、中(90mg/kg)剂量对小鼠灌胃4周后,用放射免疫法检测其对小鼠激素水平的影响,用MTT染色法、LDH释放法等检测其对小鼠相关免疫功能指标的影响.结果 复方锁阳口服液大、中剂量灌胃给药均可显著提高雄性小鼠睾丸酮水平(P<0.05),对雌性小鼠孕激素和雌二醇有明显提高作用(P<0.05);对小鼠抗体产生、淋巴细胞转化以及NK细胞杀伤功能均有明显促进作用(P<0.05),大剂量优于小剂量.结论 复方锁阳口服液能显著提高小鼠性激素水平,对小鼠免疫功能有明显促进作用.     

白细胞介素-2对小鼠神经病理性痛的镇痛作用

目的探讨白细胞介素-2(IL-2)对神经病理性痛的镇痛作用及其可能的机制,为临床治疗神经病理性痛筛选新的镇痛药物奠定基础。方法通过结扎雄性C57BL/6小鼠单侧L5/L6脊神经建立神经病理性痛模型,然后利用机械刺激和冷刺激诱发的痛觉超敏实验分别观察腹腔注射不同剂量(1.0×106、2.5×106、5.0×106u/kg)IL-2对疼痛模型小鼠患侧脚掌痛阈的影响;同时,通过5.0×106u/kg IL-2注射前30 min腹腔注射纳洛酮(1 mg/kg)以观察阿片受体拮抗剂对IL-2镇痛作用的影响。结果腹腔注射IL-2可产生剂量依赖性镇痛作用,其中5.0×106u/kg和2.5×106u/kg IL-2均可显著提高模型小鼠患侧脚掌的50%缩足阈值(P<0.01)和降低5 min抬足次数(P<0.05),镇痛效应分别维持30 min和15 min,而1.0×106u/kg IL-2无明显的镇痛作用。IL-2产生的镇痛效应不能被纳洛酮阻断。结论IL-2对小鼠神经病理性痛具有镇痛作用,其镇痛效应除受阿片受体介导外还可能有其他分子参与。     

抗HER-2工程抗体chA21和Herceptin对人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的抑制作用

目的研究抗HER-2工程抗体Herceptin及chA21对高表达HER-2的人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制。方法建立人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型,随机分组,Herceptin和chA21均按30 mg/kg体重每周两次静脉注射,连续6周给药,观察肿瘤生长变化,计算抑瘤率;利用组织芯片及免疫组化方法结合显微图像分析系统定量检测肿瘤细胞Ki-67和NFκB的表达。结果Herceptin(30 mg/kg)和chA21(30 mg/kg)能显著抑制SKOV3移植瘤的生长,抑瘤率分别为51.12%和30.53%。Herceptin组和chA21组肿瘤组织Ki-67和NFκB的表达显著低于对照组(P<0.01),而两组之间比较统计学无显著性差异(P>0.05)。结论chA21和Herceptin均能抑制高表达HER-2的SKOV3移植瘤的生长。通过抑制NFκB的表达而影响肿瘤细胞的增殖是其可能的共同分子机制之一。     

白藜芦醇对大鼠重症急性胰腺炎肠黏膜细胞凋亡的影响

目的探讨白藜芦醇对试验性大鼠重症急性胰腺炎肠黏膜细胞凋亡及凋亡调控基因Bax蛋白表达的影响。方法54只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham operation group,SO)、模型组(severe acute pancreatitis,SAP)、治疗组(resveratrol-treated group,RES)。假手术组于开腹翻动十二指肠后关腹,模型组以40 g/L牛磺胆酸钠1 mL/kg胰胆管逆行注射制造重症急性胰腺炎模型。治疗组制模后立即于阴茎背静脉注射等剂量白藜芦醇(5 mg/mL1、0 mg/kg)。于3、61、2 h 3个时间点各剖杀6只大鼠。TUNEL法检测肠黏膜上皮细胞凋亡,免疫组化法检测小肠组织中Bax蛋白的表达。结果治疗组3、6、12 h肠黏膜细胞凋亡指数明显低于模型组(P<0.01)。治疗组各时间点Bax蛋白表达阳性率显著低于模型组(P<0.01)。结论白藜芦醇可通过抑制肠黏膜上皮细胞的凋亡,维持肠黏膜屏障的完整性,从而防止了急性重症胰腺炎细菌和毒素的移居。     

罗格列酮干预前后2型糖尿病患者血清瘦素水平的变化

目的观察罗格列酮干预前后2型糖尿病患者血清瘦素水平的变化,探讨罗格列酮改善胰岛素敏感性的可能途径。方法30例新诊断的2型糖尿病患者随机分为罗格列酮组(4 mg/d)、二甲双胍组(750 mg/d)和磺脲组(达美康160 mg/d)。应用放射免疫法检测治疗前及治疗12周后的血清瘦素水平,同时检测血胰岛素和糖化血红蛋白的水平。结果药物干预前后三组的空腹血糖、糖化血红蛋白明显降低,而空腹胰岛素水平未见明显变化。罗格列酮干预后血清瘦素明显减低,胰岛素敏感性显著提高,而二甲双胍组和磺脲组未见明显变化。结论罗格列酮可能通过降低2型糖尿病患者血清瘦素的水平而改善胰岛素的敏感性。     

二维三七桂利嗪胶囊对急性脑缺血的保护作用

目的观察二维三七桂利嗪胶囊对于急性脑缺血的影响。方法ICR小鼠分别用420 mg/kg、210 mg/kg、105 mg/kg的二维三七桂利嗪胶囊灌胃10 d,观察断头后小鼠的喘息时间;SD大鼠分别用292 mg/kg、146 mg/kg、73 mg/kg的二维三七桂利嗪胶囊灌胃10 d,线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,然后进行神经行为指标评分、脑梗死范围测定和病理学观察。结果二维三七桂利嗪胶囊各剂量组均能延长小鼠断头后的喘息时间,缩小局灶性脑缺血大鼠脑梗死范围,改善神经症状,减轻光镜下脑组织缺血性损伤。结论二维三七桂利嗪胶囊对急性脑缺血损伤具有保护作用。     

高氧液预处理对心脏瓣膜置换术患者血浆丙二醛和超氧化物歧化酶的影响

目的观察高氧液预处理对心脏瓣膜置换术患者血浆丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的影响。方法30例择期心脏瓣膜置换术患者随机分为试验组和对照组,在麻醉后切皮前(T0)至心肺转流(CPB)开始后10 min,对照组静滴复方氯化钠注射液10 mL/kg,试验组给予相等容量的高氧液。分别于麻醉后切皮前(T0)、CPB开始后1 h(T1)、主动脉开放后2 h(T2)、主动脉开放后24 h(T3)共4个时点,测定MDA和SOD。结果T0时点MDA质量浓度两组间无明显差异(P>0.05),T1时显著增高,T2时达高峰,T3仍显著高于术前(P<0.05)。两组间比较,T2时试验组明显低于对照组(P<0.01)。T0时点SOD活性两组间无明显差异(P>0.05),试验组各时点无明显变化(P>0.05)。对照组T1、T2时明显降低,与试验组相比有明显差异(P<0.05)。两组心脏自动复跳率、电除颤率、心律失常发生率、术中多巴胺用量相比均无明显差异(P>0.05),术后24 h多巴胺用量,试验组明显低于对照组(P<0.01)。结论高氧液预处理能使MDA质量浓度明显下降,SOD活性保持不变,减轻心肌缺血/再灌注损伤。     

高氧液预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨高氧液预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法30只家兔随机分为三组:假手术组(A组,n=10),缺血再灌注组(B组,n=10)及高氧液预处理组(C组,n=10)。C组每天静脉给予15mL/kg高氧液,20min内匀速泵完,连续7d;A组及B组以同样方法给予等量生理盐水,最后一次处理结束后,制作心肌缺血再灌注(I/R)模型。A组只穿线,不结扎冠脉。记录心电图和血流动力学指标,在结扎前、结扎即刻、结扎后30min,再灌注1、2、3h分别测定血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果C组能明显降低心电图S-T段的升高程度并改善血流动力学参数,较B组显著缩小梗死范围(P<0.05)。与A组比较,B组血清SOD活性呈逐渐下降趋势,MDA含量则呈逐渐增高的趋势(P<0.05)。C组各时间段上述各指标均有所恢复。结论高氧液预处理对家兔在体心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。     

急性过度通气对颅内高压家犬S100B和C反应蛋白的影响

目的观察急性过度通气对颅内压增高犬脑功能的影响。方法16条急性硬膜外血肿家犬均分为4组。A组为对照组,机械通气维持PETCO2在35-45 mmHg。B、C和D组则采用过度通气,使PETCO2分别维持在28-35 mmHg、20-27 mmHg及20 mmHg以下各1 h,在术前(T1)、机械通气后2 h(T2)6、h(T3)、12 h(T4)、24 h(T5)和48 h(T6)分别测定S100B和C反应蛋白(CRP)含量。结果实验组S100B和CRP含量术后不同程度升高。D组S100B 6 h后升高,12 h达到峰值,24 h轻微下降,与术前及对照组比较差异显著(P<0.05),而CRP 2 h后增高,6 h达峰值且持续到48 h,与术前及对照组比较差异显著(P<0.05),B组、C组与对照组比较无差异。结论轻、中度过度通气对家犬脑功能影响较小,重度过度通气对硬膜外血肿犬可引起脑缺血。     

游离脂肪酸对大鼠胰岛细胞体外分泌功能的影响

目的探讨饱和脂肪酸软脂酸和单不饱和脂肪酸油酸对大鼠胰岛细胞体外分泌胰岛素功能的影响。方法体外分离大鼠胰岛细胞,分为:①浓度梯度组,将0.125、0.250、.5 mmol/L软脂酸(PA)和油酸(OA)分别与胰岛细胞共培养48 h;②时间梯度组,将0.25 mmol/L软脂酸、油酸及二者的混合物与胰岛细胞共培养24、487、2 h,进行葡萄糖刺激胰岛素释放试验,放射免疫法检测培养液中胰岛素浓度。结果①浓度梯度组,不同浓度PA和OA组葡萄糖刺激后胰岛素分泌水平均明显减少,浓度越高胰岛素分泌越少,高浓度时(0.5 mmol/L),高糖刺激下OA组胰岛素分泌高于PA组;②时间梯度组,PA、OA及混合组,葡萄糖刺激后胰岛素分泌水平均明显减少,随时间延长,胰岛素分泌逐渐减低;相同时间段,各组胰岛素分泌无差异(P>0.05)。结论PA和OA对大鼠胰岛细胞分泌功能均有一定的抑制作用,呈剂量依赖性,PA抑制程度呈时间依赖性;高浓度时PA抑制程度大于OA;OA对PA诱导的胰岛细胞分泌功能损伤无保护及协同效应。