氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的研究

目的 研究氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的作用.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测人肝癌细胞SMMC-7721生长活力;Hoechst33258核染色,观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率.结果 氯化两面针碱作用于细胞后,在体外呈浓度、时间依赖性显著抑制SMMC-7721细胞的生长,作用24、48、72h的半数抑制浓度(IC50)分别为(19.5±1.8)、(3.8±0.2)、(2.8±0.1)mg/L;Hoechst33258染色后,可见核染色质凝集,凋亡细胞呈致密浓染,与对照组相比,氯化两面针碱处理后凋亡细胞比例增加;流式细胞仪检测到G2/M细胞比例增加,G0/G1、S期细胞比例下降.药物作用于SMMC-7721细胞后,随浓度增加细胞凋亡率增加.结论 氯化两面针碱对SMMC-7721细胞有明显的生长抑制作用,可能与改变细胞周期并诱导细胞凋亡有关.     

EGCG对肝癌细胞HepG2凋亡及脂肪酸合酶表达的影响

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人肝癌HepG2细胞增殖抑制、凋亡诱导及对凋亡相关基因和脂肪酸合酶(FASN)表达的影响,明确其可能的抗肝癌作用机制。方法体外培养HepG2人肝癌细胞株,随机分为对照组(无药物干预)及80、120、160μmol/L EGCG组,作用48h后,荧光显微镜观察Hoechst33258染色结果并用流式细胞术定量分析细胞凋亡发生情况;用RT-PCR方法检测FASN及凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达。结果EGCG组Hoechst33258染色可见凋亡细胞核浓染,亮度明显加深或有染色质边集现象,亦可见典型的凋亡小体;流式细胞术检测发现,经160μmol/L EGCG作用48h后,肝癌细胞凋亡率最高可达28.6%;半定量RT-PCR结果显示,经EGCG作用48h后肝癌细胞中凋亡相关基因Bcl-2表达量明显下降,同时FASN表达量亦随EGCG浓度的增大而显著降低。Bax表达无明显变化。结论 EGCG可抑制人肝癌细胞HepG2的细胞增殖,并诱导凋亡发生,此作用可能与其抑制细胞凋亡相关基因Bcl-2以及内源性FASN的表达有关。     

c-FLIP蛋白与卵巢癌细胞对TRAIL耐药抵抗的关系

目的探索卵巢癌细胞对TRAIL诱导凋亡耐药抵抗的机制。方法分别选择12.5、25、50、100ng/mL的人重组TRAIL蛋白作用于卵巢癌细胞3AO和CAOV3,在18、24、48、72h时间点收集细胞,MTT法检测细胞的生长抑制率;原位末端标记法(TUNEL)观察凋亡细胞;流式细胞仪(FCM)检测细胞的凋亡率;Western blot检测凋亡抑制蛋白c-FLIP蛋白表达的水平。结果 TRAIL抑制了3AO和CAOV3细胞的生长增殖,24h3AO、CAOV3细胞的生长抑制率分别为28%、10%,并且TRAIL增多可诱导细胞凋亡,24h的3AO细胞凋亡率(8.5%)明显高于CAOV3(5.5%)。CAOV3细胞中c-FLIP蛋白的表达水平高于3AO细胞。结论 c-FLIP蛋白是卵巢癌细胞对TRAIL耐药抵抗的一种重要调控蛋白。     

甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞HL-7702凋亡及其机制的研究

目的 观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate, GCDC)对人正常肝细胞株HL-7702凋亡的影响,并探讨其凋亡机制.方法 终浓度分别为100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h,光学显微镜观察GCDC对HL-7702细胞形态的影响,AnnexinV-FITC/PI双染色法检测HL-7702细胞的凋亡率 ,用荧光指示剂Fluo-3/AM测定HL-7702细胞内钙离子浓度,RT-PCR测定Bcl-2、Bax基因mRNA表达水平.结果 终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h后,细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变;100、150、200、250μmol/L的GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡,呈剂量依赖性,凋亡率分别为(13.16±2.9)% (t=6.41)、(20.3±3.0)% (t=10.22)、(25.02±2.1)% (t=18.11)、(45.02±3.5)% (t=28.89),较对照组(2.2±0.6)%显著升高(P＜0.05);GCDC能使HL-7702细胞内钙离子浓度增加,且具有浓度依赖性;GCDC使细胞内Bcl-2 mRNA的表达下降、Bax mRNA的表达增加.结论 GCDC可能是通过增加HL-7702细胞内钙离子浓度,并进一步下调Bcl-2、上调Bax表达水平,从而诱导细胞凋亡.     

Aβ诱导PC-12细胞凋亡建立阿尔茨海默病细胞模型

目的　用β 淀粉样蛋白 (Aβ2 5- 35)诱导PC 1 2细胞凋亡以建立阿尔茨海默病细胞模型。方法　体外培养大鼠嗜铬细胞瘤PC 1 2细胞 ,以不同浓度Aβ2 5 - 35诱导并于不同时间收获细胞 ,应用MTT法观察细胞活力 ,Fura 2 /AM荧光分析法检测细胞内游离Ca2 +浓度 ,Hoechst332 5 8及碘化丙啶复染分析细胞凋亡。结果　Aβ2 5- 35作用于PC 1 2细胞后 ,细胞活力逐渐下降 ,并呈时间和剂量依赖性 ;同时细胞内Ca2 +浓度显著上升 ;不同浓度Aβ2 5 - 35作用后 ,PC 1 2细胞于不同时间出现凋亡的典型形态学特征 ,该时间比Ca2 +浓度上升约晚 6～ 1 2h。结论　Aβ2 5- 35诱导后PC 1 2细胞活力下降、细胞内Ca2 +浓度上升及细胞凋亡 ,可作为较理想的阿尔茨海默病细胞模型     

As2O3诱导人卵巢癌细胞株HO8910凋亡和端粒酶活性的关系

目的探讨As2O3诱导HO8910细胞凋亡和端粒酶活性变化的关系。方法用不同浓度的As2O3溶液作用卵巢癌细胞株HO8910,于不同时间点收集细胞,MTT法检测细胞生长抑制率;FCM检测细胞凋亡率;TRAP-银染法观察端粒酶活性的变化。结果As2O3溶液对HO8910有生长抑制和诱导凋亡的作用,与药物浓度和作用时间相关。不同浓度As2O3作用HO8910细胞,其端粒酶活性在24h无明显改变,随着作用时间的延长,端粒酶活性逐渐下降,随着药物浓度的升高端粒酶活性也呈不断下降趋势,以致消失。结论As2O3可以诱导卵巢癌细胞株HO8910发生凋亡,其机制可能不是通过端粒酶活性下降直接调控的,但端粒酶调控与凋亡调控有一定相关性。     

C/EBPβ在人正常肝细胞和肝癌细胞系中的差异表达及其与内质网应激相关细胞死亡的关系

目的观察转录因子C/EBPβ在人永生化正常肝细胞和肝癌细胞系中的表达差异性,探讨其与肝癌细胞内质网应激介导的细胞死亡的相关性。方法培养人永生化正常肝细胞系HHL5、HL7702和肝癌SMMC7721、Bel7402、HepG2、Hep3B细胞系;Hep3B细胞用衣霉素诱导内质网应激细胞模型;倒置光学显微镜下观察细胞形态;MTT法检测细胞生长抑制率;Hoechst 33258染色后荧光显微镜下检测细胞凋亡;RT-PCR和Western blotting技术分别检测mRNA和蛋白的表达水平。结果 C/EBPβ的mRNA和蛋白亚型C/EBPβ-1在4种人肝癌细胞系和永生化正常肝细胞系中均有表达,但C/EBPβ-3仅在人永生化正常肝细胞系中表达,在肝癌细胞系中不表达;衣霉素能够上调人肝癌Hep3B细胞C/EBPβ的mRNA和蛋白表达水平,明显上调C/EBPβ-3的表达水平;衣霉素能够诱导人肝癌Hep3B细胞内质网应激介导的细胞死亡,表现为细胞凋亡和类凋亡两种方式。结论 C/EBPβ的蛋白亚型C/EBPβ-3在人永生化正常肝细胞中表达而在肝癌细胞中不表达;C/EBPβ参与内质网应激介导的人肝癌细胞死亡。     

雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌SKOV-3细胞增殖的抑制作用

目的 探讨雷帕霉素单独及联合顺铂应用对人卵巢癌SKOV-3细胞生长的影响及可能的分子机制.方法 体外培养人卵巢癌SKOV-3细胞,实验组分别采用不同浓度的雷帕霉素、顺铂及40nmol/L雷帕霉素+10μmol/L顺铂作用,MTT法检测上述药物对细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测分析细胞凋亡率及细胞周期分布变化.结果 雷帕霉素单独及联合顺铂应用均可显著抑制人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖,其作用呈现时间-剂量依赖性,且两药联合作用时抑制率显著增高(P<0.05),显示两药有协同作用;流式细胞仪检测显示雷帕霉素能使卵巢癌SKOV-3发生G1期阻滞,同时可诱导细胞凋亡,其凋亡率随用药浓度增加而增加.结论 雷帕霉素和顺铂可显著地抑制人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,且两药联合应用时呈现协同作用.     

虎杖提取物白藜芦醇的抗白血病作用及其可能的分子机制

目的探讨白藜芦醇在体外对白血病细胞的抑制作用及其分子机制。方法MTT比色法测定细胞生长抑制率;流式细胞术、HE染色、激光共聚焦显微镜等方法观察各组白血病细胞的细胞周期与细胞凋亡情况;Western Blot-ting法测定细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平;免疫组织化学法测定白血病细胞信号转导分子p-STAT3的活性表达。结果白藜芦醇可以时间-剂量依赖的方式抑制3种白血病细胞增殖、诱导凋亡、影响细胞周期分布、减弱STAT3的酪氨酸磷酸化活性。结论白藜芦醇对不同来源的白血病细胞均具有较强的抗肿瘤活性,显著减少STAT3的酪氨酸磷酸化活性,为其进一步应用于白血病的临床治疗积累了实验依据。     

C57/BL6小鼠海马结构发生、发育和衰老过程中的细胞凋亡

目的探讨C57/BL6小鼠海马结构发生发育及衰老过程中细胞凋亡的变化规律。方法采用Hoechst 33258染色检测不同阶段C57/BL6小鼠海马结构中的细胞凋亡;免疫荧光和Western blotting技术检测不同阶段C57/BL6小鼠海马结构中Caspase-3的表达。结果 Hoechst 33258染色结果显示:胚龄(embryonic day,E)12d～18d凋亡细胞渐增多;生后(postnatal day,P)1～7d渐减少;P14d～2月主要于齿状回、海马沟和海马槽的白质区可见少量凋亡细胞;3月～18月仅在齿状回亚颗粒细胞层见零星分布。阿蒙角(Ammons horn,CA)及齿状回(dentate gyrus,DG)多形层及分子层细胞凋亡率P1～P14d渐下降。CA及DG主细胞层细胞凋亡率P1d最高,以后逐渐降低。Caspase-3免疫荧光结果示:E12～E16d阳性表达细胞渐增多;E18～P3d继续增多,主要分布于CA锥体层及DG颗粒层;P5～P14d分布渐减少;P21d～18月各区仅见少量阳性细胞表达。Western Blotting结果示E18～P3dCaspase-3表达增加;P5～P21d表达降低;P21d后趋于稳定。结论生后1d为小鼠海马结构凋亡高峰;Caspase-3为重要凋亡因子。     

血管内皮生长因子反义核酸增强华蟾素诱导K562细胞凋亡

目的 研究VEGF反义核酸(ASON)增强华蟾素对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应.方法 合成VEGF ASON转染入K562细胞,4种浓度的华蟾素(1、3、5、7mg/L)作用于K562细胞株24、48、72h,应用Western blot法检测VEGF蛋白的表达,原位细胞凋亡(TUNEL)、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡.结果 不同剂量华蟾素组对K562细胞株均有抑制作用,并具有时间和浓度依赖性.经VEGF ASON转染的K562细胞株对华蟾素的诱导凋亡作用更加明显.结论 华蟾素在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,VEGF ASON可增强华蟾素诱导K562细胞凋亡的作用.     

黄芪甲苷改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍并抑制Notch通路激活

目的 研究黄芪甲苷对高糖诱导足细胞损伤和线粒体功能障碍的保护作用及其分子机制。方法 构建高糖(30 mmol/L葡萄糖)诱导足细胞损伤模型,分别用低、中、高剂量黄芪甲苷与高糖共处理细胞;CCK-8检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,试剂盒检测ATP含量,Western blotting检测凋亡及足细胞损伤相关蛋白和Notch通路相关蛋白表达水平。结果 与control组相比,HG组细胞活性降低、细胞凋亡水平增加(P<0.05),抗凋亡蛋白(Bcl2)表达降低,凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3)表达升高(P均<0.05);和HG组相比,HG+AS-IV组改善高糖诱导的细胞活性和细胞凋亡水平(P<0.05),抗凋亡蛋白(Bcl2)表达升高,凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3)表达降低(P均<0.05);和control组比较,HG组细胞线粒体发生功能障碍,JC-1单体含量升高,ATP含量降低(P均<0.05);和...     

线粒体细胞色素c介导的caspase-9激活通路参与大骨节病关节软骨细胞凋亡的发生机制

目的通过评价线粒体功能研究线粒体介导的caspase-9激活通路参与成人大骨节病关节软骨细胞凋亡的机制。方法关节软骨细胞培养,Hoechst 33258染色检测软骨细胞核形态,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率和细胞内活性氧含量,Western bloting检测细胞色素c的表达,荧光法检测caspase-9和caspase-3活性。结果大骨节病患者关节软骨细胞较正常软骨细胞凋亡百分率增加,线粒体细胞色素c释放,caspase-9和caspase-3活性增高,且活性氧含量增加。结论线粒体氧化应激参与了大骨节病软骨细胞的病理生理变化,线粒体功能障碍可能在大骨节病关节软骨细胞凋亡过程发挥了重要作用。     

外源磷脂酰乙醇胺诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

目的 磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)在细胞凋亡的早期由细胞膜内侧翻转到外侧,与磷脂酰丝氨酸共同成为细胞凋亡的早期信号,但是其在凋亡中的作用尚不清楚.本研究探讨了PE对HeLa细胞凋亡的影响.方法 实验以人宫颈癌HeLa细胞系为材料,分别设置了空白对照组、0.125、0.25、0.5和1 mmol/L PE处理组.以MTT检测细胞生长情况,PI-流式细胞仪法检测细胞周期,Annexin V-PI法检测细胞凋亡.结果 与对照组相比,PE各处理组对HeLa细胞生长的抑制作用呈剂量与时间依赖性,并诱导细胞凋亡发生,但不影响细胞周期.结论 PE通过诱导细胞凋亡而抑制HeLa细胞的生长.     

龙葵素通过ROS/p38信号通路诱导人前列腺癌细胞凋亡

目的探讨龙葵素对前列腺癌细胞Du145和LNCaP凋亡的分子机制。方法应用MTT法检测龙葵素对Du145和LNCaP细胞活力的影响,流式细胞术检测龙葵素对Du145和LNCaP细胞中活性氧的生成及细胞凋亡的影响,Western印迹法检测龙葵素对细胞内p38和p-p38蛋白水平的影响。结果龙葵素能显著抑制Du145和LNCaP细胞的细胞活力,且呈现剂量依赖性(P<0.01),ROS清除剂NAC能显著抑制龙葵素对细胞活力的抑制作用。40μmol/L龙葵素作用细胞24h能诱导细胞ROS生成和细胞凋亡,并促进p38磷酸化,NAC能显著抑制龙葵素诱导的细胞凋亡和p38的磷酸化,p38磷酸化抑制剂能够显著抑制龙葵素诱导的细胞凋亡。结论龙葵素诱导ROS的产生,通过激活p38通路诱导人前列腺癌细胞凋亡。     

TRPC6参与内质网应激诱导的肾小球系膜细胞凋亡

目的 探讨TRPC6离子通道在内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)诱导的肾小球系膜细胞(HBZY-1)凋亡中的作用及机制。方法 实验分为正常对照组(NC)、thapsigargin(TG)、TG+SKF96365和TG+TRPC6siRNA组。qRT-PCR和Western blot技术检测TRPC6和ERS相关蛋白(GRP78和Caspase12)的mRNA和蛋白表达。流式细胞术和Hoechst33258方法检测细胞凋亡。Fluo-4AM Ca²⁺成像技术测定细胞内Ca²⁺内流(intracellular calcium,[Ca²⁺]i)的变化情况。结果 TG组细胞出现核浓缩或核碎裂为特征的凋亡形态变化,细胞凋亡率增加。TRPC6和ERS相关蛋白(GRP78和Caspase12)的表达明显高于NC组(P<0.05)。SKF96365和TRPC6 siRNA预孵育HBZY-1细胞可减轻细胞凋亡(P<0.05)。TG刺激后[Ca²⁺]i也增加(P...     

Flavopiridol诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的分子机制

目的探讨flavopiridol诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的分子机制。方法以TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot测定Mcl-1、CyclinD2、Bcl-XL、Bag-1和XIAP等。结果在临床剂量的flavopiridol浓度下,MM细胞系在加药后3 h内出现快速凋亡。不同剂量的flavopiridol均可快速诱导Mcl-1表达下调和CTD磷酸化的抑制,flavopiridol抑制CTD磷酸化的剂量与其抑制Mcl-1表达的剂量密切相关。该剂量也是其诱导MM细胞凋亡的剂量。转录抑制因子放线菌素D及flavopiridol均能抑制Mcl-1表达,并可诱导原代MM细胞凋亡。结论转录抑制因子放线菌素D和CDK抑制剂flavopiridol诱导MM细胞凋亡可能与其抑制CTD磷酸化,从而抑制Mcl-1的mRNA以及蛋白质水平有关。     

人宫颈癌细胞凋亡的研究

目的　观察顺铂、60 Co在宫颈癌细胞凋亡的作用及其引起的细胞形态学、DNA及细胞周期变化。方法　将人宫颈癌细胞株Hela,SiHa和RJC进行体外培养 ,用不同强度的放射线60 Co照射 ,观察照射后不同时间内肿瘤细胞形态变化 ,并采用末端脱氧核苷酰转移酶标记法 (TDT法 )检查细胞DNA有无断裂 ,用流式细胞仪记录细胞周期的改变和Bcl 2蛋白表达情况。同时将顺铂处理的宫颈癌细胞作为对照组 ,观察放射线和药物对宫颈癌细胞的联合作用。结果　经60 Co照射的三株细胞均出现凋亡的典型形态学改变 ,TDT法染色见受照细胞核内均有DNA断裂表现 ;细胞周期进展受到阻滞 ;Bcl 2蛋白表达在Hela细胞升高 ,而在SiHa和RJC细胞则降低 ,SiHa细胞对60 Co照射最为敏感 ,40 0CGy即可出现细胞凋亡的改变。顺铂单独处理可使宫颈癌细胞凋亡 ,与放射线联用有明显的增强细胞凋亡的效果。并在RJC细胞的G1 峰前出现凋亡峰。结论　宫颈癌细胞受到60 Co照射后 ,凋亡是其主要死亡形式 ,不同的宫颈癌细胞株对放射线的敏感性存在明显差异 ,与细胞凋亡有关的Bcl 2表达与宫颈癌细胞凋亡的发生呈负相关 ,放射线照射与化疗药物联合可以增加抑制宫颈癌生长的作用。     

促凋亡蛋白Caspase-3与白血病细胞耐药的相关性

目的观察阿霉素(ADR)耐药的人慢性粒细胞白血病细胞株K562/AO2在ADR和雄黄作用下细胞活力、凋亡及加入Caspase-3抑制剂前后Caspase-3酶活性的变化,探讨促凋亡蛋白Caspase-3与白血病细胞耐药的关系。方法①四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定药物作用下细胞株的细胞活力(A值);②DNA琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况;③酶显色活性分析法(CAA)测定Caspase-3活性水平的变化。结果①MTT法:K562/AO2细胞的A值与雄黄呈时间、剂量依赖关系。②雄黄作用组有凋亡发生。③未加抑制剂组Caspase-3活性明显升高(P<0.05),对雄黄呈时间、剂量依赖关系,加入抑制剂后此关系消失,对ADR无此关系。结论Caspase-3酶活性水平的变化能显著影响药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力,在肿瘤耐药的发生发展中起着重要的作用。     

羟基红花黄色素A对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的观察羟基红花黄色素A(HSYA)对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用,并探讨其作用机制。方法采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率;二乙酸二氯荧光素盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)含量;罗丹明123(Rhodamine123)染色法检测细胞线粒体膜电位;Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达。结果 1mmol/L MPP+处理SH-SY5Y细胞48h后,细胞存活率显著降低,并诱导细胞产生凋亡,凋亡率达(38.6±1.8)%。而HSYA(15、60、120μmol/L)预处理1h,可明显增加SH-SY5Y细胞存活率(P<0.001),并能有效抑制MPP+诱导的细胞调亡(P<0.01);可明显抑制MPP+诱导的细胞内ROS的增加(P<0.001);也能有效抑制MPP+诱导的细胞线粒体膜电位的降低(P<0.01)。120μmol/L HSYA预处理能显著性增加Bcl-2/Bax比值(P<0.01);能够明显抑制MPP+诱导的胞质Cyt-C的释放(P<0.05)和Caspase-3、Caspase-9的高表达(P<0.05,P<0.05)。结论 HSYA预处理能明显提高MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的细胞存活率,可有效抑制细胞调亡的发生,其机制可能与抑制细胞线粒体凋亡途径有关。