体外诱导人脐血CD34~+细胞向肝细胞的分化

目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50 mL/L FBS,1×ITS,4.7 mg/L亚油酸,10-4mol/L 2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16 d时留取细胞。通过RT-PCR对ALB、AFP、GATA-4等mRNA的表达水平进行检测;用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达,并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%,达到分离要求。RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16 d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞,ELISA检测表明诱导组8、16 d培养液中的ALB质量浓度明显增高,与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论在体外培养条件下,脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。     

多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案

目的探讨胚胎干细胞(ESCs)体外定向分化为胰岛祖细胞的分化潜能,应用多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高胚胎干细胞向胰岛祖细胞分化的效率。方法体外传代培养ESCs,采用逐步筛选分化方案,在不同的分化阶段,给予不同的生长因子诱导分化后,RT-PCR法检测胰腺特异性基因的表达,筛选最佳的诱导因子组合,并用免疫细胞化学方法鉴定相关特异蛋白的表达,从而建立体外高效的定向分化方案。结果从未分化ESCs定向分化为定形内胚层细胞,以活化素A诱导组的Sox17和Foxa2基因表达最显著;从定形内胚层细胞分化到后前肠细胞,以维甲酸+FGF10诱导组的Hnf4a和Hnf6基因表达最显著;从后前肠细胞定向分化到胰腺内胚层细胞,以维甲酸+环杷明+DAPT+Exendin 4诱导组的Pdx1、Ptf1a、Hblx9等胰腺特异性基因表达最显著;从胰腺内胚层细胞定向分化到胰岛祖细胞,以维甲酸+DAPT+Exendin 4诱导组的Ngn3、Nkx6.1、Pax4、Pax6等基因表达最显著。免疫细胞化学方法检测可见胰腺特异性的相关蛋白表达,多数Ngn3+细胞同时表达胰腺特异性基因Nkx6.1和Pdx1。结论应用多步骤诱导逐步筛选法可以建立高效的ESCs定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高ESCs向胰腺内胚层分化的分化效率,为1型糖尿病的β细胞再生治疗提供试验依据和可行性方案。     

TGF-β1对成人骨髓CD105~+间充质干细胞增殖与分化的影响

目的分离并鉴定成人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),研究TGFβ1对骨髓MSCs增殖与分化的影响。方法分离成人骨髓单个核细胞;MACS磁珠分选CD105+细胞;FACS检测其免疫表型;诱导分选的CD105+细胞向脂肪及成骨细胞分化,油红O染色、VonKossa染色及RTPCR检测脂肪细胞及成骨细胞;观察TGFβ1对分选出的CD105+细胞分化与增殖的影响;免疫荧光染色检测诱导后的脂肪细胞CD105的表达情况;MTT法检测TGFβ1对CD105+细胞增殖的影响。结果成人骨髓来源的CD105+细胞体外可向脂肪及成骨细胞分化;在向脂肪细胞分化过程中,加入1～50ng/mLTGFβ1后,成脂诱导体系中无脂肪细胞出现;在向成骨诱导过程中,加入20ng/mLTGFβ1后,钙化基质沉淀明显降低;在脂肪诱导体系中,MTT染色检测显示TGFβ1对CD105+细胞的增殖有明显促进作用(P<0.05)。结论TGFβ1抑制成人骨髓源CD105+MSCs向脂肪及成骨细胞分化,在向脂肪诱导过程中,TGFβ1促进MSCs的增殖。     

自体外周血纯化CD34+细胞移植对系统性红斑狼疮患者外周血CD4+CD25+T细胞表达的影响

目的研究自体外周血纯化造血干细胞移植对系统性红斑狼疮(SLE)患者CD4 CD25 T细胞表达的影响。方法15例接受自体外周血纯化造血干细胞移植的SLE患者列入研究,应用流式细胞技术动态监测移植前及移植后3、6、12、24个月的CD4 CD25 T细胞表达水平。结果自体外周血造血干细胞移植治疗前SLE患者外周血的CD4 CD25 T细胞表达明显低下,移植后3个月出现增高,移植6、12、24个月后达正常水平。复发者外周血CD4 CD25 T细胞的表达水平明显低于非复发者,差异有统计学意义(P<0.01)。结论自体外周血纯化CD34 细胞移植可通过促进CD4 CD25 T细胞的表达发挥治疗作用。     

TGF-β诱导骨髓干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)对骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的影响。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用TGF-β1对第二代MSCs定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学技术检测诱导后4周MSCs结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白T(CTnT)及p38MAPK的表达情况,并根据CTnT这一心肌源性特异性标记物的阳性率,分析心肌细胞的转化率;同时,以半定量RT-PCR方法在诱导后7、21、28d检测细胞心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性肌凝蛋白重链α-MHC的表达。结果①加入TGF-β1诱导后的MSCs,于7d时形态已转变成类长柱形,28d时细胞体积则变小,呈条梭状排列,可观察到类肌管样结构。②TGF-β1诱导4周后的MSCs均可见desmin、α-sarcomeric actin及p38MAPK阳性细胞。诱导组的心肌样细胞转化率均显著高于对照组(P均<0.01)。③RT-PCR结果显示,诱导组细胞GATA-4于诱导后7d弱表达,21d表达增强,28d表达减弱。α-MHC在诱导后7d不表达,21d弱表达,28d表达明显。结论骨髓间充质干细胞在TGF-β诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究

目的建立人破骨样细胞体外培养的方法,探讨1α,25-(OH)2D3、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、前列腺素E2(PGE2)等骨吸收刺激因子对破骨细胞分化、增殖和功能的影响,为进一步研究正畸牙齿移动的生物力学机制奠定基础。方法将脐血单核细胞接种于预置盖玻片和骨片的24孔培养板中,实验组分别加入诱导因子1α,25-(OH)2D3、M-CSF、PGE2,对照组不加,每3 d换液一次,培养7 d。采用倒置相差显微镜、TRAP染色等方法观察破骨样细胞的形成情况。结果第3天实验组单核细胞出现融合趋势,第7天TRAP染色可见阳性的多核破骨样细胞,但尚未形成骨吸收陷窝,以1α,25-(OH)2D3组破骨样细胞形成数量最多。结论脐血单核细胞经1α,25-(OH)2D3、M-CSF、PGE2体外诱导培养后可分化为TRAP( )多核的破骨样细胞,且10-8mol/L的1α,25-(OH)2D3具有最强的生物学效应。     

不同浓度Wnt-11诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的实验研究

目的探讨Wnt-11体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为心肌样细胞的最适浓度。方法采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMMSCs,取第2代BMMSCs培养48h后进行定向诱导,根据Wnt-11终浓度的不同分为A组(100ng/mL),B组(200ng/mL),C组(400ng/mL)和D组(空白对照组),诱导72h后更换为完全培养液继续培养4周,D组仅用完全培养液培养。倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化。运用流式细胞仪检测技术对BMMSCs表面联合标记物进行鉴定。各组细胞培养至第4周时,运用免疫细胞化学染色技术检测结蛋白(Desmin)、间隙连接蛋白43(Connexin43)及心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达情况。运用透射电镜观察分化细胞的超微结构变化。实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测各组细胞在诱导后培养第1、2、4周时心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5及α-MHC的表达。结果 1原代BMMSCs于第2周形成集落,多呈梭形、星形,少数形状不规则。传代后细胞体积变大,诱导后细胞多为长梭形,呈一致性生长。2流式细胞仪检测技术对BMMSCs表面联合标记物的鉴定结果显示CD29、CD45、CD90的阳性表达率分别为97.9%、0.4%和99.5%。3免疫细胞化学染色技术检测结果显示:诱导后常规培养至第4周,A组、B组、C组细胞胞质均呈阳性表达Desmin、Connexin43和cTnI,而D组细胞呈弱阳性或阴性表达,B组细胞的阳性表达率均最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4透射电镜结果显示:各诱导组细胞于诱导后常规培养至第4周,胞质内可见平行排列的肌丝及亚细胞结构如线粒体、粗面内质网和核糖体。5RT-qPCR检测结果显示:BMMSCs经诱导后,常规培养第1周时各诱导组细胞均表达GATA-4及Nkx2.5基因,在第2周时表达减弱,在第4周时表达增强,就基因表达而言,三个诱导组相比较,B组明显优于其他两组(P<0.05)。α-MHC基因在诱导后常规培养期间均不表达。对照组细胞在常规培养期间GATA-4及Nkx2.5基因的表达量为1,而不表达α-MHC基因。结论 Wnt-11可在体外诱导SD大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化最适浓度为200ng/mL。     

姜黄素对CD34~+CD38~-KG1a细胞增殖和凋亡的影响及其与白消安的协同效应

目的探讨姜黄素对CD34+CD38-KG1a细胞增殖和凋亡的影响以及姜黄素联合白消安对CD34+CD38-KG1a细胞的协同效应。方法流式细胞术检测细胞CD34、CD38表面抗原的表达情况、姜黄素诱导CD34+CD38-KG1a细胞的凋亡情况及其对CD34+CD38-KG1a细胞周期的影响。MTT法检测姜黄素对CD34+CD38-KG1a的增殖抑制作用及其与白消安联合作用的效应。甲基纤维素克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。倒置光学显微镜观察细胞凋亡形态。Western blot检测Bcl-2蛋白表达水平。结果 KG1a细胞株中CD34+CD38-KG1a细胞占(98.2±3.2)%。姜黄素对CD34+CD38-KG1a细胞具有增殖抑制作用,呈时间-剂量依赖性,并能降低CD34+CD38-KG1a细胞的克隆形成能力。姜黄素与白消安相互作用系数(CDI)<1。CD34+CD38-KG1a细胞被姜黄素阻滞于G0/G1期,S期细胞明显减少,并能诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡。凋亡细胞体积变大,细胞结构不清,胞膜边缘粗糙。姜黄素能下调CD34+CD38-KG1a细胞Bcl-2蛋白表达水平。结论姜黄素通过降低细胞克隆形成能力、阻滞细胞于G0/G1期和诱导细胞凋亡,抑制CD34+CD38-KG1a细胞的增殖,姜黄素与白消安具有协同作用。Bcl-2蛋白表达水平下调可能促使姜黄素诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡。     

压力与牙周膜细胞对体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的 研究持续静压力和人牙周膜细胞对体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的影响,初步探讨静压力和牙周膜细胞在正畸性骨改建中的作用机制.方法 密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.用组织块酶消化法培养获得牙周膜细胞.建立transwell共培养系统,下层接种脐血单个核细胞,上层接种牙周膜细胞.A组为单核细胞与牙周膜细胞共培养加力;B组为单核细胞培养加力,另设不加力对照组A'、B'组.采用倒置相差显微镜观察及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞的形成及功能.结果 A组下层细胞在加力后第2天出现细胞融合现象,3 d时可见明显的多核破骨样细胞,TRAP染色阳性,骨磨片染色可见典型的骨吸收陷窝.其他组仅有极少量多核细胞形成,未见骨吸收陷窝.结论 静压力作用下,牙周膜细胞可以刺激脐血单核细胞分化为破骨样细胞.     

子宫内膜基质干细胞的体外成骨诱导和成脂诱导分化

目的探讨子宫内膜基质干细胞的多向分化潜能。方法取因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的子宫内膜组织,磁珠分选子宫内膜基质干细胞,进行传代培养。传代细胞分别加入成骨诱导剂和成脂诱导剂培养,并通过茜素红和油红O染色对成骨细胞和脂肪细胞形态进行鉴定。结果子宫内膜基质干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成骨、成脂诱导培养3周后形态、体积发生明显改变。茜素红染色显示细胞团中央能形成钙化结节;成脂诱导后油红O染色可见细胞质内出现橙红色脂滴。结论子宫内膜基质干细胞经体外诱导培养后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,并具有明显的成骨和成脂细胞形态,表明子宫内膜基质干细胞具有多向分化潜能。     

CD4~+CD25- CD45RB~(high) T细胞转移性肠炎模型的建立

目的建立CD4+CD25-CD45RBhighT细胞转移性肠炎模型,并分析其在炎性肠病中的研究价值。方法流式细胞仪分选和纯化CD4+CD25-CD45RBhighT细胞并通过静脉注射移植到Rag1-/-小鼠,记录每组小鼠体质量变化,根据标准程序制作结肠组织切片进行HE染色检查,分离肠黏膜固有层CD4+T细胞并采用ELISA方法检测TNF-α和IFN-γ的表达水平。结果 CD4+CD25-CD45RBhighT细胞重建Rag1-/-小鼠3周后出现体质量下降,至第6周时体质量下降更加急剧并伴有明显腹泻。结肠组织切片结果发现明显的炎性细胞浸润,结肠上皮出现局灶性溃疡,炎症进一步蔓延至黏膜下层。结肠黏膜固有层CD4+T细胞TNF-α和IFN-γ的表达水平明显高于对照组。结论CD4+CD25-CD45RBhighT细胞转移性肠炎模型在研究炎性肠病的发病机制中具有重要作用。     

体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞的分化

目的 建立体外非接触共培养模型,诱导小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肺泡上皮细胞的分化.方法 分三组,每组6例.对照组:小鼠MSCs单独培养组;实验组A:正常肺组织单细胞悬液+MSCs;实验组B:损伤肺组织单细胞悬液+MSCs.共同培养8d,激光共聚焦和RT-PCR检测共培养体系下室中的SP-C和AQP5的表达情况.结果 对照组和实验组A都只检测到AQP5;而实验组B可同时检测到AQP5和SP-C.实验组B的AQP5 mRNA的表达量较对照组明显增多(P<0.01),而与实验组A比较,其AQP5 mRNA的表达量也有统计学差异(P<0.01).但是,实验组A与对照组比较则无明显统计学差异(P>0.05).结论 本实验室成功建立了体外非接触诱导小鼠MSCs分化为肺泡上皮细胞的实验模型.     

骨骼肌中存在CDla^＋细胞

目的 研究骨骼肌中CDla^ 细胞的形态、分布及功能。方法 4例人骨骼肌样本采用CDla抗体进行免疫组织化学染色．光镜观察。结果 骨骼肌纤维之间、肌束膜和肌外膜的血管壁、神经纤维、脂肪组织中的CDla^ 细胞呈带状、灶状或散在分布。CDla^ 细胞大小不等，形态多样，常有突起。突起粗细、长短、多少不等，其突起可与周围或远处的CDla^ 细胞或突起相连；骨骼肌纤维之间的CDla^ 细胞也可与肌膜紧密相连。结论 骨骼肌纤维之间的CDla^ 细胞可能是肌卫星细胞的某一分化阶段；骨骼肌中各种组织内的CDla^ 细胞也可能是相应组织成熟细胞的前体状态，并参与相应组织结构的形成和维持。     

小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定

目的建立分离培养及鉴定小鼠肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells,GNCSCs)的方法,为临床应用奠定基础。方法分离胚鼠肠管,消化后接种于添加N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基,贴壁培养;连续传代后用血清促进GNCSCs分化;最后用免疫细胞化学方法染色鉴定。结果分离培养的细胞聚集生长,形成的克隆球可以传代;克隆球p75染色阳性;分化后的细胞分别表达肠神经元、神经胶质细胞和平滑肌细胞特异性抗原。结论分离培养的克隆球具有自我更新和多向分化的能力,表达肠神经嵴干细胞的特异性抗原p75,是肠神经嵴干细胞。     

早期人胚神经干细胞分布及分离培养

目的　研究发育早期人胚脑神经干细胞的形态特征及其分布情况 ,并观察其体外生长分化特性。方法　计划生育流产的 6～ 12周胚胎大脑组织切片用vimentin抗体进行免疫组织化学染色 ,光镜观察。机械分离皮质细胞 ,用无血清培养基和含血清培养基进行悬浮和贴壁培养 ,分别用MAP2 、GFAP及GalC抗体进行免疫细胞化学染色 ,鉴定干细胞和神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结果　发育早期大脑Vimentin阳性细胞分布广泛 ,细胞形态单一 ,多呈圆球形 ,体积较小。体外培养的大脑皮质细胞在培养的第 5～ 7天时 ,形成较多克隆 ,可多次传代 ;贴壁培养时细胞发生分化 ,分别为MAP2 、GFAP、GalC阳性的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结论　胚胎发育早期大脑神经干细胞分布广泛 ,形态单一 ,皮质Vimentin阳性细胞数量多 ,便于分离 ,是最佳神经干细胞分离部位 ;人NSCs可以在体外增殖并发生多向分化