用PCR技术标记双链DNA探针

利用ＰＣＲ技术制备生物素或地高辛标记的ＤＮＡ探针，经原位杂交试验及敏感性和特异性检测，均取得满意效果。ＰＣＲ标记法具有经济、快速、简易和标记量大等优点。实践中发现Ｂｉｏ／Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ的质量、ｄＴＴＰ和Ｂｉｏ／Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ的比例及起始ＤＮＡ模板浓度是标记成败的关键。     

一种简单快速的血清HBV－DNA模板的制备方法

一种简单快速的血清ＨＢＶ－ＤＮＡ模板的制备方法党双锁，徐仓宝，歧天茂，顾晓慧（医学分子生物学研究室西安７１００６１）ＰＣＲ技术已被广泛用于检测血清乙肝病毒（ＨＢＢ）ＤＮＡ［１］，以便确定是否有ＨＢＶ感染和有无传染性。在ＰＣＲ中，模板制备至关重要，优质...     

用PCR法检测胸液中结核杆菌DNA

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测了３２例结核性渗出性胸膜炎和２０例非结核性疾病患者胸液中结核杆菌的６５ＫＤａ抗原蛋白编码基因的特异ＤＮＡ片段。结果表明，其检出率为７８．１３％，并具高度特异性。提示ＰＣＲ扩增ＤＮＡ技术对结核性渗出性胸膜炎是高度敏感和特异的早期、快速诊断方法。     

PCR法区别HBVRC－和CCC－DNA

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的基因组为一松弛环状、部分双链的ＤＮＡ（ＲＣ－ＤＮＡ）。在其负链的５＇与３＇端之间存在一缺口。当ＨＢＶ进入宿主细胞后，基因组转变为共价闭合环状ＤＮＡ（ＣＣＣ－ＤＮＡ）。我们根据ＨＢＶＲＣ－和ＣＣＣ－ＤＮＡ的结构特点，设计了ＰＣＲ区别ＲＣ－和ＣＣＣ－ＤＮＡ。实验表明，该方法可有效地区别两种形式的ＨＢＶＤＮＡ。     

血清中结核菌DNA的PCR扩增及其意义

血清中结核菌ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增及其意义王香玲，李妙羡，何谦，田增爵（西安第二附属医院检验科西安７１０００４）近年来应用ＰＣＲ技术诊断结核病的报道越来越多，但用血清作为标准来源较少，为此我们对临床确诊的６３例结核病患者的血清用ＰＣＲ技术扩增其结核菌特异...     

聚合酶链反应检测弓形虫核酸的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，设计了一对寡核苷酸引物，对弓形虫Ｂ１基因的保守序列进行体外扩增，显示该引物只对弓形虫核酸扩增，可对４个或４个以上弓形虫扩增出明显条带，检测弓形虫核酸的最低量为２．５ｐｇ。该ＰＣＲ对急性感染弓形虫的小鼠，于４８ｈ后就可从部分小鼠（２／５）的外周血中检测到弓形虫核酸，９６ｈ后全部小鼠（５／５）外周血中均检测到弓形虫核酸，而感染２４ｈ后可从其肝、脾、肾等组织中扩增到弓形虫核酸。对３４例孕妇外周血分别用ＥＬＩＳＡ及ＰＣＲ平行检测，ＥＬＩＳＡ测ＩｇＭ阳性者３例，ＰＣＲ扩增阳性者６例（其中３例ＩｇＭ亦阳性），表明ＰＣＲ具有较高的敏感性和特异性。     

胎儿SRY基因用于产前诊断的初步研究

采用ＰＣＲ技术，对５０例胎儿组织ＤＮＡ进行了Ｙ染色体特异的ＳＲＹ基因扩增。扩增片段长度为２５０ｂｐ。结果显示：３２例早孕绒毛ＤＮＡ中，有１７例扩增出特异性片段．１５例未扩增出特异性片段，有、无特异性片段比例为１．１３３：１，接近胎儿自然出生性别之比；１８例中孕引产胎盘ＤＮＡ中８例阳性，１０例阴性，与引产胎儿实际性别完全一致。因ＰＣＲ扩增胎儿ＳＲＹ基因特异性强、灵敏度高，可用于早期胎儿性别的产前诊断。     

散发性帕金森病α—synuclein基因突变的检测

目的 探讨α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因右突变与散发性帕金森病人的关系。方法 分离ＰＤ组和对照组的外围血基因组ＤＮＡ，采用α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｘ基因特异引物对其第四外显子进行ＰＣＲ扩增，扩增产物用Ｔｓｐ４５Ⅰ酶切鉴定。结果 两组ＰＣＲ均可扩增出２１６ｂｐ的片段，ＰＣＲ产物不能被Ｔｓｐ４５Ⅰ酶切。结论α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因已知点突变与散发性帕金森病可能无明确关系。     

PCR法检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV DNA

采用ＰＣＲ法检测了７７例乙肝患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中ＨＢＶＤＮＡ，２７例阳性，总阳性率为３５．１％。慢性活动性肝炎（９／２１，４２．９％），肝炎后肝硬化（９／１９，４７．４％）及重型肝炎（８／１６，５０．０％）患者ＰＢＭＣＨＢＶＤＮＡ阳性率明显高于慢迁肝（１／１４，７．１％）和急肝（０／７）患者。结果提示ＰＢＭＣ中ＨＢＶＤＮＡ的存在在乙肝发病机理中具有一定意义。     

PCR测定沙门氏菌,霍乱弧菌和副溶血弧菌的研究

从沙门氏菌鞭毛素基因序列，副溶血弧菌耐热溶血素基因序列和霍乱弧菌肠毒素基因序列中分别选择并合成一对引物，其ＰＣＲ扩增产物２６４Ｂｐ，２９３ｂｐ和２９２ｂｐ。对这三种菌的标准株，临床株及无关菌株的ＰＣＲ测定及酶切鉴定，均显示良好的特异性。     

用PCR-SSCP方法研究子宫颈癌组织中人乳头瘤病毒E_7基因的变异

运用核酸杂交和聚合酶链式反应（ＰＣＲ）对临床确诊的６１份子宫颈癌Ⅱ～Ⅲ期标本进行了人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ７基因的检测。非同位素地高辛标记探针斑点杂交阳性检出率为４５．９％，ＰＣＲ检测阳性率为５４．１％，两种检测结果证实ＨＰＶ－１６型感染与子宫颈癌的发生密切相关。进一步用灵敏的单链构象多态性分析法（ＳＳＣＰ）对３３例阳性标本进行分析，发现有２７例单链ＤＮＡ迁移率与正常对照有不同，推测均发生了ＤＮＡ序列的改变，提示ＨＰＶ－１６Ｅ７基因的变异在子宫颈癌组织中是较常见的现象，其与子宫颈癌的发生有一定的关系。     

套式RT-PCR检测肾综合征出血热病毒方法的建立及应用

针对汉坦病毒（Ｈａｎｔａｎｖｉｒｕｓ,ＨＶ）中国代表株（Ａ９、Ｒ２２）Ｍ基因片段设计分型引物（Ⅰ、Ⅱ型）,采用改进的异硫氰酸胍酚一步法（胍酚法）提取汉坦病毒ＲＮＡ,套式ＲＴ－ＰＣＲ检测稀释病毒上清,模拟病人血清和２０例急性期（１～７ｄ）血清样本。结果：能检测到模拟血清中少至几个ＰＦＵ病毒ＲＮＡ,敏感性５～１０ｆｇ。检测过程可在５ｈ内完成。２０例急性期患者血清检测阳性率为１００％,并能进行临床分型。扩增产物经打点杂交证实其特异性。而正常及非ＨＦＲＳ患者血清结果均为阴性。提示：套式ＲＴ－ＰＣＲ基因诊断技术优于传统的ＭａｃＥＬＩＳＡ、ＩＦＡＴ和ＲＰＨＩ诊断法。     

微量PCR法快速鉴定重组质粒

微量ＰＣＲ法快速鉴定重组质粒郭晏海，赵君庸，苏成芝，闫小君，肖乐义（西安生物化学教研室西安７１００６１）在分子生物学技术中，应用菌落原位杂交筛选目的基因的重组ＤＮＡ，由于它敏感而且特异性较高，已逐渐成为一种较为普遍的方法。但是该方法费时而且步骤繁琐，...     

大鼠视觉相关脑区表达序列标签的克隆与鉴定

目的 分析视觉相关脑区基因的差异表达并获取新的表达序列标签。方法 利用差异显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）技术分析大鼠外侧膝状体与视皮层基因差异表达情况，并筛选差异表达基因片段。结果 经ＤＤＲＴ－ＰＣＲ筛选并通过反Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法除假阳性，最终获得１个差异表达基因片段。对其进行克隆、测序和同源性比较发现，该片段为一新的表达序列标签，并与心肌集钙蛋白的ｍＲＮＡ具有７４％的同源性。结论 视觉     

PCR介导化学合成广谱细胞生长因子基因半分子

建立一种通过ＰＣＲ介导的单链法人工合成基因的新方法。方法采用固相亚磷酰胺法，化学合成广一长因子基因５’端半分子各寡核苷酸片段，其间按搭桥方式相接，通过重叠ＰＣＲ扩增的方法以获得全长半分子基因，再通过带酶切位点的两端引物扩增，以获得大量特异的半分子基因。     

人白细胞介素-2 cDNA导入对卵巢癌耐药细胞株耐药性的逆转

为了构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并探讨白细胞介素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ导入对顺铂诱导的卵巢癌耐药细胞株耐药性的影响。我们采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段，构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒。导入顺铂诱导的人卵巢癌耐药细胞株，观察其耐药性的改变。结果成功构建了ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并在Ｃｏｓ－７细胞高效表达，导入卵巢癌耐药细胞后其对顺铂的敏感性显著升高。说明转导ｐｃＤ－ＮＡ－ＩＬ－２基因的人卵巢癌耐药细胞株其耐药性有明显逆转，而且ＩＬ－２亦可逆转非ｍｄｒ１依赖的耐药性     

孕妇外周血PCR技术用于胎儿产前性别诊断的可靠性分析

采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术，以Ｙ染色体特异重复序列Ｙ１．１、Ｙ１．２和ＳＲＹ基因编码区Ｐ１、Ｐ２为引物，分析了用孕妇外周血进行胎儿性别诊断的可靠性，并与绒毛样本进行了对比。结果表明：用孕妇外周血时，Ｙ１．１，Ｙ１．２引物的诊断符合率为７５％；Ｐ１、Ｐ２引物不能扩增出Ｙ特异ＤＮＡ序列。而用绒毛样本时，两种引物的诊断符合率均为１００％。结果提示：孕妇外周血ＰＣＲ技术用于胎儿性别诊断尚有待改进，而采用绒毛样本进行胎儿性别诊断更为可靠。     

小儿肾病综合征红细胞膜电荷变化

观测３６例肾病综合征（ＮｅｐｈｒｏｔｉｃＳｙｎｄｒｏｍｅ，ＮＳ）患儿红细胞（ＲＢＣ）膜电荷量及１８例ＮＳ患儿ＲＢＣ表面涎酸含量的变化。结果表明，ＮＳ患儿ＲＢＣ膜ＡＢ结合量较正常儿童明显降低（Ｐ＜０．００１）；表面涎酸含量与正常儿童相比无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。提示：ＮＳ时ＲＢＣ膜电荷呈“功能性”降低；ＮＳ患儿尿蛋白量与其ＲＢＣ膜电荷量呈负相关（ｒ＝－０．５３４，Ｐ＜０．００１）。     

f—PSA／PSA比值对前列腺癌的诊断意义

前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA)自被发现以来，受到临床上高度重视，经深入研究，目前以认为诊断前列腺癌（prostatic cancer,PCa)极具临床价值的指标。但ＰＳＡ仅对前列腺组织特异而非ＰＣa特有，作为早期诊断ＰＣa的指标还缺乏足够的敏感性和特异性。特别是血清中ＰＳＡ在（４－１０）μg/L时，ＰＣa与许多良性前列腺疾病（尤其是良性前列腺增生（bening prostatic hyperlasia,BPH)及值重叠。近期研究发现血清中ＰＳＡ以不同分子形式存在，其主要与α１－抗糜蛋白酶（α１－ＡＣＴ）和α２－微球蛋白（α２－ＭＧ）结合形成复合物，另外存在少量的游离ＰＳＡ（free prostate specific antigen,f-PSA），正是f-PSA对区分ＢＰＨ和ＰＣa有非常重要的意义。为此，本文对经临床医师行直肠指检（digital rectal examination,DRE)后疑有前列腺疾患病人１００例作血清ＰＳＡ，f-PSA检测，算出f-PSA／ＰＳＡ比值，探讨与ＰＣa的关系，报告如下。     

用聚合酶链反应检测口腔癌组织中人乳头状瘤病毒的E_6转化基因

作者采用聚合酶链反应（ＰＣＲ），并对照核酸斑点杂交法对１０例口腔恶性肿瘤组织中ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因进行了检测。这些肿瘤包括６例口腔粘膜鳞癌（ＳＣＣ），２例涎腺腺样囊性癌（ＡＣＣ），１例涎腺恶性多形性腺瘤（ＭＰＡ）和１例腭部软组织胚胎性横纹肌肉瘤（ＥＲ）。对照组为１０例非肿瘤组织，包括唇裂、腭裂粘膜组织标本各５例。结果表明两种方法检测结果基本一致，肿瘤组阳性６例（６／１０），包括４例ＳＳＣ，１例ＡＣＣ和１例ＥＲ（除外１例ＡＣＣ用核酸杂交法检测为弱阳性），其余为阴性；对照组用核酸杂交法检测４例，除１例唇裂标本为弱阳性以外，均为阴性（０／４）；用ＰＣＲ法检测１０例均为阴性结果（０／１０）。两组间ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因的检出率有明显差异（Ｐ＜０．０５）。这一结果为开展口腔癌的ＨＰＶ病因学研究提供了参考资料。