人神经生长因子的基因克隆和序列分析

目的　克隆人神经生长因子基因编码区。方法　由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ,利用PCR法 ,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段 ;将获得的基因片段插入 pGEM T Easy质粒中 ,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果　经质粒DNA酶切分析及序列测定 ,获得了人神经生长因子DNA片段序列。结论　首次由人白细胞DNA中克隆获得了人神经生长因子基因 ,为神经生长因子的基因治疗提供了前提条件。     

人类OPRM1-EXON1的克隆与探针的制备

目的　克隆、测序人类 OPRM1- EXON1,并用非同位素 生物素标记法对该基因进行标记、制备探针,用于OPRM1- EXON1的表达及功能研究。方法　通过PCR法扩增目的基因片段,并将其连接到pGEM- T载体上,转入感受态细胞中进行重组并克隆,经酶切和基因测序进行鉴定,用非同位素 生物素标记法进行探针的标记与制备。结果　经过PCR扩增的目的基因片段大小(2.2 kb)与理论上片段大小一致,经过测序证实其序列与 NCBI提供的序列相同,用此片段成功的制备了用于研究阿片受体基因的探针。结论　从基因组中成功克隆了人类 OPRM1- EX ON1,并制备了探针,为深入研究吗啡依赖相关基因及基因表达创造了必要的条件。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型DNA中BamHIC片断结构和功能的研究——Ⅰ.BamHI C片断的次级克隆和酶谱分析

运用DNA重组技术对单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)DNA分子的BamHI C片断进行了次级克隆,建立了该基因片断中8个片断的无性繁殖系。同时利用核酸限制性内切酶的多酶解技术,对该片断作了酶谱分析。     

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。     

人ECK基因外显子3的实验研究

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon 3在肿瘤形成中的作用奠定了基础     

饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达

目的　通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法　应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段 ,并克隆到pUC1 9载体中 ,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列 ,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX 4T 1表达载体中 ,经BamHI和EcoRI双酶切后 1 2 %凝胶电泳鉴定 ,IPTG诱导表达产物经SDS PAGE分析。结果　克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF1 3830 0记载的序列完全一致 ,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65 6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论　本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST Decorin融合蛋白     

NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

大鼠视觉相关脑区表达序列标签的克隆与鉴定

目的 分析视觉相关脑区基因的差异表达并获取新的表达序列标签。方法 利用差异显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）技术分析大鼠外侧膝状体与视皮层基因差异表达情况，并筛选差异表达基因片段。结果 经ＤＤＲＴ－ＰＣＲ筛选并通过反Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法除假阳性，最终获得１个差异表达基因片段。对其进行克隆、测序和同源性比较发现，该片段为一新的表达序列标签，并与心肌集钙蛋白的ｍＲＮＡ具有７４％的同源性。结论 视觉     

人脑源性神经营养因子基因克隆及序列分析

目的　克隆人脑源性神经营养因子 (hBDNF)基因并进行序列分析。方法　提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板 ,应用PCR技术和T 载体克隆法克隆hBDNF基因 ,筛选阳性克隆、酶切鉴定 ,并进行序列测定和分析。结果　DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列 (M6 1 1 81 )比较 ,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744bp ,序列完全相同。结论　自人基因组DNA中克隆hBDNF基因 ,为进一步开展阿尔茨海默病 (AD)的基因治疗积累了资料。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)基因组无性繁殖系建立(简讯)

<正> 我们分析研究了HSV-2基因结构的基本特点。以限制性内切酶BglⅡ消化HSV-2DNA。得到了13个片段,并用我们自己改建的具有单一BglⅡ酶切点的质粒PHO-314为载体对HSV-2 BglⅡ基因片段进行了克隆化,在国内首次建立了HSV-2基因组的无性繁殖系。经分析鉴定克隆的基因片段e、G,I、J、L、N,O、P,Q、R可占总基因组的60％以     

β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法用PCR扩增BACE特异性小干扰RNA,转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒,再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中,通过限制性酶切对该重组表达载体进行鉴定。结果成功构建了BACE真核表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE。结论pLXSN/EGFP-U6-siBACE载体的成功构建对进一步利用基因干扰技术治疗阿尔茨海默病的研究奠定了重要的基础。     

沙眼衣原体D型MOMP基因的克隆和序列分析

目的　从D型沙眼衣原体培养物中克隆主要外膜蛋白(MOMP)基因。方法　利用细胞培养法扩增沙眼衣原体后,提取基因组为模板,经聚合酶链反应(PCR)扩增全长MOMP基因,并用酶切、PCR扩增及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果　成功扩增了MOMP基因,并插入克隆载体 pUCmT中。结论　MOMP基因的克隆为进一步开展沙眼衣原体的疫苗研究奠定了基础。     

牙龈卟啉菌蛋白酶rgp Acd基因表达载体的构建

目的构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd,插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b/rgpAcd,通过限制性酶切鉴定。结果PCR产物电泳结果显示,在大约1.5 kb处有一特异的条带,与预期的大小一致,核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性,未发生任何突变;构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致,表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功。结论成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

福氏2a志贺菌301株染色质基因文库的构建

目的　构建福氏 2a志贺氏菌 3 0 1株染色质DNA基因文库 ,为下一步全基因组序列测定打下基础。方法　Murry法提取福氏 2a志贺氏菌染色质DNA ,采用鸟枪法策略 ,分别经 8种限制性内切酶消化后克隆至载体质粒中 ,并经双脱氧链末端终止法测序后计算重组质粒重复率。结果　Murry法提取福氏 2a志贺氏菌染色质DNA大小为 3 0Kb以上 ,共构建 86 3 2个重组质粒 ,质粒重复率为 1 %。结论　本研究在国际上首次成功构建了福氏 2a志贺氏菌株染色质DNA基因文库 ,文库全长为福氏 2a志贺氏染色质的 6倍 ,已足够全基因组序列测定所需。     

T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达

目的克隆Graves’病患者甲状腺组织T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8目的基因,重组为CTLA-4-TCRVβ8基因并表达出融合蛋白。方法RT-PCR从Graves病患者甲状腺组织中克隆T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8基因,依次与表达质粒进行连接,双酶切及测序鉴定获得正确的重组子;原核表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western-Blotting检测蛋白表达情况。结果基因克隆扩增出CTLA-4和TCRVβ8目的基因片段,测序结果证实序列与已发表的一致。重组基因原核表达出与预期分子质量大小相符的目的蛋白。结论成功构建和表达了CT-LA-4-TCRVβ8基因,为探索Graves’病免疫耐受治疗提供了基因产品。     

TAT-BACEsp-GFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建穿膜肽基因和BACE底物肽融合基因与绿荧光融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础.方法 利用非对称互补引物/模板法制备两端含有酶切位点的TAT-BACEsp融合基因的cDNA,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实获得的TAT-BACEsp产物与设计的完全吻合;TAT-BACEsp准确克隆入FUGW的多克隆位点.结论 成功构建了TAT-BACEsp与GFP 融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗提供了适合的稳定转染的载体.     

人工合成广谱细胞生长因子全基因

目的 利用ＰＣＲ介导的半酶促半化学法人工合成经改造的广谱细胞生长因子基因。方法 将基因依据其限制性内切酶切点分为左中右三个区段。化学合成若干寡核苷酸小片段,利用ＰＣＲ的方法介导寡核苷酸小片段之间的连接。最后将三条基因区段基因区段组合为完整的基因。结果 各区段及全基因的序列经测定与设计方案相符。结论 广谱细胞茵子基因的成功合成为将来的表达与应用研究创造了条件,同时证明ＰＣＲ介导的人工基因合成法是一种     

猴细小病毒Vp2的克隆、表达和鉴定

目的　克隆、表达和鉴定猴细小病毒 (simianparvovirus,SPV)Vp2蛋白。方法　用设计的SPVVp2区的特异性引物 ,PCR法扩增SPVVp2基因DNA片断 ;将获得的基因片断插入 pThioHisA载体中 ,转化大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切和核酸序列分析技术鉴定重组质粒 ;以LB培养液培养转化有插入SPVVp2基因的pThioHisA载体的大肠杆菌 ,以终浓度 1mmol·L -1的IPTG诱导蛋白的表达 ;用SDA PAGE和Westernblot分析和鉴定表达的蛋白。结果　经限制性内切酶酶切和核酸序列分析 ,获得了插入pThioHisA载体框架的SPVVp2基因的表达质粒 ;阳性转化大肠杆菌在IPTG诱导下获得了SPVVp2蛋白的表达 ;SDA PAGE和用抗 Thio及抗 SPVVp2的特异性抗体的Westernblot分析证实了表达蛋白的特异性。结论　获得了SPVVp2基因的表达质粒并在大肠杆菌中得了高效表达 ,为进一步建立SPV感染的检测方法和研究SPV的血清流行病学等奠定了基础。