通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

携带CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

目的构建携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默CIP2A表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成CIP2AshRNA,退火形成双链与pDC316-EGFP-U6质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒pDC316-EGFP-CIP2AshRNA,以鉴定正确的pDC316-EGFP-CIP2AshRNA克隆为模板PCR扩增EGFPCIP2AshRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR扩增产物及pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA,建立载体细胞株BHK/CIP2A-shRNA,采用AAV MaxTM包装系统大规模制备rAAV2-EGFPCIP2AshRNA并对其纯化及滴度测定。将rAAV2-EGFP-CIP2AshRNA感染肝癌细胞HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP作对照,采用Real-time PCR及Western blot方法检测CIP2AshRNA基因沉默效果。结果携带编码CIP2AshRNA腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;将重组质粒与辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-21,成功制备重组腺相关病毒rAAV2-CIP2AshRNA,经测定纯化所得rAVV2病毒滴度为0.25×1012v.g./mL。筛选MOI值为1×105感染肝癌细胞HepG2,CIP2A mRNA及蛋白表达水平分别于感染后24h和48h与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体rAAV2-CIP2AshRNA。     

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以EcoRⅠ和BamHⅠ将腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%～94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10~(13)vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的hTSHR289蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。     

人脑源性神经营养因子重组腺伴随病毒的制备

目的　构建并产生人脑源性神经营养因子 (humanbrain derivedneurotrophicfactor ,hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno associatedvirus,AAV)载体。方法　将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG Neo的EcoRI BamHI位点 ,构建重组质粒pSSHG Neo/hBDNF。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的重组质粒 ,三质粒磷酸钙共沉淀法转染 80 %融合的 14 3细胞系 ,包装AAV hBDNF。经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　重组病毒AAV hBDNF滴度约为 4 .86× 10 14 颗粒·L-1。结论　成功制备了重组病毒AAV hBDNF ,为神经退行性疾病基因治疗实验奠定了基础     

人神经生长因子重组腺伴随病毒载体的构建

目的　为了研究人神经生长因子 (hNGF)基因导入急性脊髓损伤 (SCI)模型的治疗作用 ,构建并产生重组腺伴随病毒 (AAV)载体。方法　将hNGF外源性核酸片段插入AAV shuffer质粒 pSSHG Neo的KpnⅠ BamHⅠ位点构建AAV。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的pSSHG Neo三质粒磷酸钙共沉淀法在肾胚胎 2 93细胞系中同源重组包装rAAV。使用地高辛标记的斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　成功构建了重组病毒质粒pSSHG/hNGF ,经蔗糖梯度离心法获得rAAV组分 ,梯度稀释测得滴度为 1.4 6× 10 12 PFU·mL-1。结论　成功地制备了人神经生长因子重组腺伴随病毒 (rAAV/hNGF)载体 ,为SCI基因治疗实验奠定了基础。     

表达HCV core-Ant的重组慢病毒的构建

目的 构建表达HCV 核心区的重组慢病毒,以探讨HCV感染后该病毒核心蛋白对肝脏干细胞转分化的影响.方法 利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得HCV core-Ant基因克隆,酶切后连入pLenti6/V5-D-TOPO质粒,得到pLenti6/V5-D-HCV core-Ant,连同pLP/VSVG、pLP1和pLP2四质粒共转染293ET细胞,获得了表达HCV core-Ant重组慢病毒.收集病毒上清,大量扩增,用免疫组化法检测目的 基因在Hela细胞的表达.用类似的方法构建了表达EGFP的重组慢病毒并测定其滴度.结果 克隆出HCV core-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;使用表达HCV core-Ant重组慢病毒感染Hela细胞,免疫组化实验证实胞浆有HCV core表达.使用表达EGFP的重组慢病毒感染3T3细胞见到绿色荧光,说明构建慢病毒载体有效.结论 通过分子克隆体外重组技术成功制备了表达HCV core的重组慢病毒,为进一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础.     

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。     

携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建

目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒,为探讨AcSDKP(乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸)的多样化功能提供基础。方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板,PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段,插入腺相关病毒载体穿梭质粒pSSHG-CMV,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞,包装rAAV-NT4-AcSDKP,RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。结果成功合成NT4-AcSDKP基因,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP,包装获得滴度为3.40×1010 copies/mL的重组腺相关病毒。结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒,为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。     

兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定;应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性.结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs,HE染色显示细胞均一性好;CD44强阳性表达,CD34阴性表达.诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性,ALP染色阳性;成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性,油红"O"脂肪染色阳性.结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力.     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

复合人工骨修复股骨头骨缺损的影像学研究

目的　研究用复合人工骨治疗股骨头坏死的效果。方法　建立双侧股骨头内骨缺损模型 ,并分为 4组 :bBMP 胶原 珊瑚复合人工骨组 (5侧 )、肌骨瓣组 (5侧 )、单纯珊瑚组 (4侧 )、对照组 (1 4侧 ,为以上各组的对侧 )。造模及植入后定时行X线、核素骨显像、MRI及CT检查。结果　①核素骨显像示 :6周及 1 2周 ,Ⅰ组股骨头核素摄取量静态相头 /干比升高 ,但血流相及血池相不升高。②MRI:1 0周示Ⅰ组骨缺损内多量新生骨形成 ,Ⅳ组骨缺损内囊腔中为脂肪性信号 ,周围为低信号的硬化带。③拍片及CT示 :1 4～ 1 6周 ,Ⅰ组骨缺损大多完全闭合 ,珊瑚已吸收 ,其余各组骨缺损部分残留 ,Ⅳ组骨缺损囊壁硬化带形成。结论　该复合人工骨有较强的传导成骨及诱导成骨作用 ,是修复股骨头骨缺损的良好移植材料 ,但它不能改善缺血坏死股骨头的血供。     

颌骨创伤性骨囊肿

<正> 颌骨创伤性骨囊肿是一空腔或含有少量液体并有薄层结缔组织囊壁而无上皮衬里的骨囊肿。自从1929年Lucas首先报导以来,文献报导颌骨创伤性骨囊肿已有256例。morris,Hansen,Heubner、Beasley以及Kurol等许多学者先后收集了大量病例并复习了文献,对颌骨创伤性骨囊肿进行了叙述,均认为自曲面体层摄影发明后,颌骨创伤性骨囊肿不像以前那样少见了。Joseph统计近二十年的病例报导是以前的两倍,而且,绝大多数病人是在常规X线照像时发现。所以,此囊肿应引起口腔工作者的注意。关于命名1946年Rushton对颌骨创伤性骨囊肿制定了诊断标准,Howe,morris等复习近代文献,对创伤性骨囊肿更进一步确定临床特征,病理和处理方法,都未能解释它的病因,故至今对这个囊肿的命名没有统一认识,因此尚有以下名称:进行性骨腔、潜在性骨缺     

骨体质性疾病的国际命名

<正> 为了描述和区分新的疾病,1969年首次在巴黎建立了一个骨疾病国际命名表。由于这些疾病的记述和分类迅速进展,因此在1977年5月修正了这个国际命名。新表包括的类型是明确可以认知的单纯疾病或缺陷。“其他类型”指尚未明确到能列入表内之类型。这个修正对以前建议的术语尽可能小的作了一些修改,主要目的是介绍上次会议后到现     

仿生骨植入钛网管固定修复兔骨缺损

目的探讨MHA-bBMP仿生骨作为替代骨对有限接触式钛网管固定下兔股骨干缺损模型的修复作用。方法48只新西兰大白兔随机分组,实验组:MHA-bBMP仿生骨+钛网管;对照组:自体髂骨移植+钛网管。于股骨干中段截除10 mm,建立兔股骨干缺损模型,将MHA-bBMP仿生骨/自体髂骨植入骨缺损处加有限接触式钛网管固定修复骨缺损。观察兔一般情况,检测血碱性磷酸酶,进行X线片、病理组织、电镜等观察。结果钛网管组织相容性好,固定稳定有效,两组均修复了骨缺损。两组血碱性磷酸酶、X线片表现、病理组织、电镜检查的数据经统计分析无显著性差异。结论有限接触式钛网管对植入物和骨缺损断端起到可靠的固定作用;MHA-bBMP仿生骨与自体髂骨植入相比较,诱导成骨活性相当。     

经皮注射骨形态发生蛋白复合PVP载体修复股骨头骨缺损的实验研究

目的　研究经皮注射骨形态发生蛋白 (BMP)复合可溶性载体聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)是否能促进股骨头骨缺损的修复 ,探讨治疗股骨头骨缺损的新方法。方法　将 2 0只成年兔犬股骨头部制成骨缺损模型 ,实验分四组 ,注射BMP与PVP复合组 ,单纯注射BMP组 ,自然修复组和正常组。通过X线片、组织病理学、碱性磷酸酶、新生骨钙磷含量测定和生物力学等手段检测其成骨性能。结果　注射BMP PVP组术后 1 2周全部发生骨性愈合 ,而单纯注射BMP及自然修复组无 1例发生骨性愈合。结论　经皮注射BMP PVP复合物具有促进骨修复的作用 ,有可能成为治疗骨缺损的一种方法。     

骨组织再生策略的思考及膜性负压假说

骨组织属缓慢再生组织,如何缩短骨折愈合时间,如何提高骨修复障碍如骨缺损、骨不连、骨坏死的治愈率,一直是骨科临床研究的热点,也是临床治疗中的难题之一。在隔膜技术引导骨组织再生和负压技术促进软组织再生技术的基础上,结合作者负压技术对骨髓间充质干细胞生物学特性影响及负压对兔颅骨缺损的修复的研究,提出膜性负压技术诱导骨组织再生的新理论。本文就此新理念的提出的背景、机制、应用前景作一阐述。     

股骨头内松质骨移植观察

目的　了解股骨头内松质骨移植后的病理变化 ,为股骨头坏死治疗提供理论基础。方法　 80只日本白兔分实验组 (股骨头内骨质刮除 ,自体松质骨移植 )和对照组 (股骨颈骨折后原位内固定 ) ,进行病理组织学、X线和血管造影观察。结果　松质骨移植后股骨头可完全修复 ,且较对照组效果好。结论　髓腔血供可修复股骨头 ,故提供血管修复的环境很重要 ,而股骨头坏死治疗中血管植入可能只起加快修复作用     

自制磷酸钙骨水泥人工骨的生物安全性

目的　评价自制磷酸钙骨水泥人工骨 (CPC)的生物相容性。方法　将CPC人工骨制成生理盐水浸提液 ,培养L 92 9细胞 ,观察浸提液对L 92 9细胞生长和相对增殖度的影响 ,评价CPC人工骨对细胞的潜在毒性作用 ;将CPC人工骨制成一定大小和形状植入新西兰兔股部肌肉 ,观察植入后不同时期试样周围组织反应程度 ,评价CPC对组织的刺激性和相容性。结果　CPC对L 92 9靶细胞未见毒性作用 ;植入后对周围组织、肌肉无刺激反应。结论　CPC人工骨有良好的生物相容性     

螺旋CT骨密度测定对种植前牙槽骨骨质的评价

目的对临床种植义齿患者术前行颌骨三维CT影像学检查,探讨影像学检查对临床牙槽骨骨质分类的指导意义。方法选取将行种植义齿治疗的患者作为受测者,对其术前感兴趣区应用多层螺旋CT扫描进行牙槽骨CT灰度值及Marker横截面的灰度值测量。结果①Ⅰ~Ⅳ类骨质分类的CT平均骨密度相对灰度值不同(F>1,P<0.05);②上颌前后牙区、下颌骨前后牙区CT平均骨密度相对灰度值有明显差异,且下颌前牙区骨密度值最大(F>1,P<0.05);③男女性别在骨质分类上无统计学差异(P>0.05);④年龄段分组比较中差异有统计学意义(F>1,P<0.05),且30~39岁的骨密度灰度值最大。结论多层螺旋CT的相对骨密度灰度值可以客观评估种植前的骨质情况。     

非洛地平对SD大鼠骨组织形态学的影响

目的 明确非洛地平灌胃对SD大鼠骨质代谢的作用,确定其对骨质疏松的影响,为临床用药提供直接的动物实验证据.方法 SD大鼠132只,随机分为对照组及非洛地平高、中、底剂量组.对照组每天给予蒸馏水灌胃,非洛地平高、中、低剂量组分别每天给予非洛地平0.15、0.45、1.25mg/kg体重灌胃.3、4、5、6月后进行右侧股骨全长HE染色,计算平均骨小梁密度(MTPD)、平均骨小梁间距(MTPS)、平均骨小梁厚度(MTPT)、骨小梁间连接点数(TB.n)、骨小梁末端数(FFT)等静态参数.结果 ①3、4个月后,各组大鼠以上指标均无明显差异(P＞0.05);②5个月后,非洛地平高、中剂量组与正常对照组和低剂量组相比MTPD、MTPT、TB.n明显减低(P＜0.05),MTPS、FFT则明显增加(P＜0.05);③6个月后,非洛地平低剂量组与其他组相比,MTPD、MTPT、TB.n均明显增加(P＜0.05),MTPS、FFT明显减少(P＜0.05);而非洛地平高、中剂量组相比正常组,MTPD、MTPT、TB.n均明显减少(P＜0.05),MTPS、FFT明显增大,高剂量组尤甚(P＜0.05,P＜0.01).结论 非洛地平短期应用对大鼠股骨组织学结构无影响.随着用药时间的延长,中、高剂量能引起骨丢失;低剂量则能抑制骨吸收,利于向增加骨强度的方向发展,有效地保护骨骼.