促凋亡蛋白Caspase-3与白血病细胞耐药的相关性

目的观察阿霉素(ADR)耐药的人慢性粒细胞白血病细胞株K562/AO2在ADR和雄黄作用下细胞活力、凋亡及加入Caspase-3抑制剂前后Caspase-3酶活性的变化,探讨促凋亡蛋白Caspase-3与白血病细胞耐药的关系。方法①四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定药物作用下细胞株的细胞活力(A值);②DNA琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况;③酶显色活性分析法(CAA)测定Caspase-3活性水平的变化。结果①MTT法:K562/AO2细胞的A值与雄黄呈时间、剂量依赖关系。②雄黄作用组有凋亡发生。③未加抑制剂组Caspase-3活性明显升高(P<0.05),对雄黄呈时间、剂量依赖关系,加入抑制剂后此关系消失,对ADR无此关系。结论Caspase-3酶活性水平的变化能显著影响药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力,在肿瘤耐药的发生发展中起着重要的作用。     

K562／A02细胞株核因子-KB活性与P糖蛋白的表达

目的 探讨K562／A02细胞株NF-kB活性与P—gP表达的关系。方法 在K562／A02白血病耐药细胞株培养中加入NF-kB抑制剂PDTC，观察在不同浓度、不同时间下，细胞株NF-kB活性的变化与P—gP表达的关系。结果在不同浓度、不同时间的PDTC作用下，K562／A02细胞株NF-kB活性与P—gP表达呈正相关的关系，随干预浓度、时间的不断变化，二者均逐渐下降。结论 NF-kB调控的白血病细胞抗凋亡机制中有MDR1的参与。     

K562/A02细胞株核因子-κB活性与P糖蛋白的表达

目的探讨K562/A02细胞株NF-κB活性与P-gp表达的关系。方法在K562/A02白血病耐药细胞株培养中加入NF-κB抑制剂PDTC,观察在不同浓度、不同时间下,细胞株NF-κB活性的变化与P-gp表达的关系。结果在不同浓度、不同时间的PDTC作用下,K562/A02细胞株NF-κB活性与P-gp表达呈正相关的关系,随干预浓度、时间的不断变化,二者均逐渐下降。结论NF-κB调控的白血病细胞抗凋亡机制中有MDR1的参与。     

血管内皮生长因子反义核酸增强华蟾素诱导K562细胞凋亡

目的 研究VEGF反义核酸(ASON)增强华蟾素对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应.方法 合成VEGF ASON转染入K562细胞,4种浓度的华蟾素(1、3、5、7mg/L)作用于K562细胞株24、48、72h,应用Western blot法检测VEGF蛋白的表达,原位细胞凋亡(TUNEL)、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡.结果 不同剂量华蟾素组对K562细胞株均有抑制作用,并具有时间和浓度依赖性.经VEGF ASON转染的K562细胞株对华蟾素的诱导凋亡作用更加明显.结论 华蟾素在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,VEGF ASON可增强华蟾素诱导K562细胞凋亡的作用.     

aptamer-siRNA核酸复合物对K562细胞凋亡的促进作用

目的观察aptamer-siRNA核酸复合物对人慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法使用不同浓度的aptamer-siRNA溶液转染K562细胞,噻唑蓝(MTT)法检测aptamer-siRNA对K562细胞增殖的影响,AnnexinV/PI双染法检测aptamer-siRNA对K562细胞凋亡的影响,Western blot和RT-PCR法检测aptamer-siRNA对K562细胞bcl-2、Bax和caspase-3蛋白及mRNA表达的影响。结果与对照组相比,转染aptamer-siRNA后K562细胞增殖受到明显抑制,K562细胞的早期凋亡率明显增加,细胞中bcl-2蛋白和mRNA的表达水平明显降低,Bax和caspase-3蛋白和mRNA的表达水平明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。aptamersiRNA核酸复合物浓度(50~250μmol/L)对bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA的影响具有明显的量效关系。结论aptamer-siRNA核酸复合物能够通过促使bcl-2基因减少和Bax、caspase-3基因增长,进而促进K562细胞凋亡。     

苦参碱对体外培养的人ACHN肾癌细胞的生长抑制作用及其机制

目的 观察苦参碱对体外培养的人ACHN肾癌细胞的生长抑制作用,并探讨其可能的作用机制.方法 应用不同浓度的苦参碱分别作用于人肾癌ACHN细胞株24、48、72、96h,采用MTT 法观察苦参碱对ACHN的细胞毒作用;透射电镜和流式细胞术检测苦参碱对ACHN细胞凋亡的影响;免疫细胞化学技术检测苦参碱对ACHN细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响.结果 不同浓度的苦参碱对ACHN细胞株均有一定的增殖抑制作用,且呈量效和时效关系;苦参碱能明显诱导ACHN细胞株凋亡;苦参碱作用后,ACHN细胞株Bax蛋白表达明显增强,Bcl-2蛋白表达有下降趋势,但无统计学差异.结论 苦参碱对体外培养的人肾癌ACHN细胞株有显著的增殖抑制作用,其机制可能与调节Bcl-2/Bax蛋白表达比值、诱导细胞凋亡有关.     

藏红花素抑制谷氨酸盐诱导的视网膜神经节细胞凋亡

目的研究藏红花素通过影响Ca~(2+)内流对谷氨酸盐诱导的视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的影响及可能机制。方法分离大鼠RGCs,以0.1、1mmol/L的谷氨酸盐刺激RGCs 24、48h,建立RGCs凋亡模型,并用0.1、1.0、3.0μmol/L浓度梯度藏红花素分别处理。Annexin V-FITC/PI双标检测细胞凋亡率,Fluo-3/AM荧光标记Ca~(2+)检测胞内钙离子浓度,Western blot检测藏红花素对胞内钙离子介导的凋亡信号分子calpain和CaMKⅡ表达的影响。JC-1荧光染色和Western blot分别检测藏红花素对线粒体膜电位和线粒体凋亡相关信号分子Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2/Bax表达的影响。结果 0.1mmol/L谷氨酸盐刺激24h,RGCs细胞凋亡率与对照组差异无统计学意义(P>0.05);而当刺激48h时,RGCs的凋亡率达到(43.050±2.616)%,差异有统计学意义(P<0.01)。高剂量谷氨酸盐(1mmol/L)刺激24、48h的RGCs凋亡率为(46.450±1.061)%和(45.500±3.253)%,较对照组均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。用1mmol/L谷氨酸盐刺激RGCs 12h后加入0.1、1.0、3.0μmol/L藏红花素再处理12h,不同浓度藏红花素均可显著抑制细胞凋亡(P<0.01),且抑制效率具有剂量依赖性。另外,1.0μmol/L藏红花素组的谷氨酸盐诱导的胞外Ca~(2+)内流减少及钙依赖蛋白Calpain1和CaMKⅡ的表达减弱,线粒体膜电位增高,Caspase-3和Caspase-9的表达减少,Bcl-2/Bax表达上调。结论藏红花素抑制谷氨酸盐诱导的RGCs凋亡,其机制可能与阻止胞外Ca~(2+)内流,抑制钙依赖的凋亡信号通路和线粒体凋亡信号通路有关。     

结核分枝杆菌Hsp16.3表达与感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡的关系

目的探讨结核分枝杆菌(MTB)小分子热休克蛋白Hsp16.3表达与感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡的关系。方法分别将MTB国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变菌株(△H37Rv)、结核杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株(H37Rv)以及无菌生理盐水溶液(空白对照)通过小鼠尾静脉注入小鼠体内以建立小鼠的感染模型,并在感染后的1、3、5、7、9、11、13、15d分离及鉴定小鼠肺泡巨噬细胞,用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定MTB感染小鼠肺泡巨噬细胞;流式细胞术检测不同时间点感染小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率;Western blot技术检测小鼠肺泡巨噬细胞内半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白的表达。结果△H37Rv菌株感染组和H37Rv菌株感染组凋亡率均高于空白对照组,△H37Rv组的巨噬细胞凋亡率在感染1⁷d内逐渐升高,至感染7d时达到高峰,随后呈下降趋势,与H37Rv组相比,17d内逐渐升高,至感染7d时达到高峰,随后呈下降趋势,与H37Rv组相比,1⁷d及137d及13¹5d,△H37Rv组的巨噬细胞凋亡率高于H37Rv组,差异有统计学意义(P<0.05);H37Rv组和△H37Rv组的巨噬细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平均高于空白对照组;115d,△H37Rv组的巨噬细胞凋亡率高于H37Rv组,差异有统计学意义(P<0.05);H37Rv组和△H37Rv组的巨噬细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平均高于空白对照组;1⁷d内,H37Rv感染组和△H37Rv感染组的巨噬细胞Caspase-3表达水平逐渐升高,至第7天达到高峰,且△H37Rv感染组在第13天时出现第二次高峰,但Caspase-3表达水平均高于H37Rv感染组,差异有统计学意义(P<0.05);在感染的早期(17d内,H37Rv感染组和△H37Rv感染组的巨噬细胞Caspase-3表达水平逐渐升高,至第7天达到高峰,且△H37Rv感染组在第13天时出现第二次高峰,但Caspase-3表达水平均高于H37Rv感染组,差异有统计学意义(P<0.05);在感染的早期(1⁷d),△H37Rv感染组Bcl-2的表达水平无明显变化(P<0.05),但在9d后逐渐升高;H37Rv感染组巨噬细胞内Bcl-2的表达水平17d),△H37Rv感染组Bcl-2的表达水平无明显变化(P<0.05),但在9d后逐渐升高;H37Rv感染组巨噬细胞内Bcl-2的表达水平1⁷d内无明显变化(P<0.05),7d后逐渐升高,但△H37Rv感染组Bcl-2的表达水平始终低于H37Rv组且7d后表现更为显著。结论在MTB感染的早期和晚期,MTB小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够有效抑制小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡,而这种抑制作用可能是通过抑制凋亡蛋白酶Caspase-3的表达,同时促进Bcl-2蛋白的表达来实现的。     

β-榄香烯增强柔红霉素杀伤人类白血病细胞的作用及机制

目的探讨β-榄香烯(β-elemene)对白血病细胞的耐药逆转及其对聚腺苷二磷酸聚合酶(PARP)和P-糖蛋白(P-gp)表达的影响。方法取对数生长期人类髓系白血病K562细胞的柔红霉素(DNR)耐药株K562/DNR及其敏感株K562细胞,采用台盼蓝拒染法测定其对β-榄香烯的药物敏感性及耐药逆转,采用流式细胞术PI染色检测细胞凋亡,采用流式细胞术检测细胞内药物累积,Western blot检测蛋白PARP和P-gp的表达,应用SPSS(13.0软件包)进行统计学分析。结果β-榄香烯明显抑制K562和K562/DNR细胞的生长,呈剂量依赖关系。低毒剂量(5μg/mL)β-榄香烯作用K562/DNR细胞,显著提高了柔红霉素的细胞毒作用,IC50降低至(0.68±0.43,P<0.05),逆转倍数为1.91倍。与柔红霉素单药组相比,加入低毒剂量β-榄香烯后,细胞药物蓄积明显增加(P<0.05)。β-榄香烯作用后诱导PARP裂解,同时下调了P-gp蛋白表达。结论β-榄香烯部分逆转K562/DNR细胞对柔红霉素的耐药性,其逆转机制与增加细胞内药物的蓄积、诱导PARP裂解及降低P-gp的表达有关。     

DADS抑制食管胃交界部腺癌细胞OE19增殖及诱导凋亡的机制

目的探讨二烯丙基二硫化物(DADS)体外抑制食管胃交界部腺癌细胞株OE19增殖并诱导凋亡的作用及相关机制。方法 DADS处理OE19,倒置显微镜下观察细胞形态变化;MTT检测DADS对OE19细胞的增殖抑制作用;使用流式细胞术分析不同浓度DADS处理OE19后的凋亡率;Real-time PCR检测DADS对OE-19细胞Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax以及NF-κB mRNA表达水平的影响。结果作用24、48h后,DADS可以抑制OE19增殖,抑制作用呈剂量依赖性。使用40、80μg/mL的DADS处理OE19细胞24、48h,凋亡细胞比例分别为14.0%、25.4%和19.0%、27.2%。Real-time PCR检测发现DADS能够上调OE19细胞Caspase-3、Caspase-9mRNA的表达,并且能够下调NF-κB、Bcl-2mRNA的表达,且呈剂量-反应关系,Bcl-2/Bax的比值明显降低。结论 DADS在体外能够抑制食管胃交界部腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡,其凋亡机制可能是通过线粒体途径,同时NF-κB通路以及Bcl-2家族成员均参与了该过程。     

萘乙酸抑制K562细胞增殖作用的初步研究

目的研究萘乙酸(NAA)对K562细胞增殖的抑制作用。方法应用MTT法、细胞计数法、流式细胞术、分裂指数分析、tunnel法以及姊妹染色单体交换(sister chromatid exchange,SCE)和微核制备,对NAA处理的K562细胞进行细胞增殖、细胞周期、凋亡以及染色体损伤检测。结果与对照组相比,NAA可以有效抑制K562细胞的生长,并将细胞阻滞在G1期,降低细胞分裂指数,促进细胞凋亡,提高K562细胞SCE频率以及微核形成率。结论NAA具有抑制K562细胞增殖的作用。     

Study of the mechanism on the apoptosis induced in Human leukemia cell line K562 by the combination of indole-3-acetic acid and horseradish peroxidase

Objective To investigate the mechanisms of apoptosis induced in Human leukemia cell line K562 by the combination of indole-3-acetic acid and horseradish peroxidase. Methods Human leukemia cell line K562 were exposed to indole-3-acetic acid （IAA） at 20, 40, 60, 80 or 100 mol/L and horseradish peroxidase（HRP） at 1.2 g/mL for varying times. MTT assay was applied to detect the cell proliferation. Flow cytometry was performed to detect the arrest of cell cycle. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） assay was used to measure apoptosis. 2, 7-dichlorofluorescin diacetate （DCFH-DA） uptake was measured to determine free radical by confocal microscope. Content of malondiadehyde （MDA） and activity of superoxide dismutase （SOD） were measured by biochemical methods. Results IAA/HRP initiated growth inhibition of K562 cells in a dose- and time-dependent manner. Flow cytometry revealed that cell cycle arrested at G1/G0 after 24 hours treatment. After 72 hours treatment, apoptotic rate of 100 mol/L IAA group increased to 43.9 %, which was 5 times that of control（P〈0.01）. Content of MDA and activity of SOD increased respectively in treatments compared with control. Meanwhile, IAA/HRP stimulated the formation of free radical, which was increased by IAA concentration-dependently. Conclusion The combination of IAAand HRP can inhibit the growth of Human leukemia cell line K562 in vitro by inducing apoptosis which is associated with the increase of free radical. The combination of IAA and HRP might be a promising chemopreventive and chemotherapeutic agent against human leukemia.     

K562细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的　构建K5 6 2细胞表达型cDNA文库。方法　提取K5 6 2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5’端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的λgt11噬菌体连接 ,体外包装后建成cDNA文库。取出 1μL倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果　构建成含 1.0 2× 10 6重组子的K5 6 2细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.3kb。结论　所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆。     

辛伐他汀对人慢性粒细胞白血病细胞K562基因表达的影响

目的应用基因芯片技术研究辛伐他汀对K562细胞基因表达的影响,初步探讨其作用机理。方法辛伐他汀作用K562细胞48h后,提取细胞总RNA。纯化mRNA后再逆转录为cDNA,将cDNA在体外转录合成cRNA,用随机引物反转录为cDNA,用Klenow酶标记Cy3、Cy5,与定制的包含人全基因组的基因芯片杂交,扫描芯片荧光信号,用GenePixPro4.0图像分析软件对芯片图像进行分析。定量RT-PCR验证芯片结果中两个差异表达基因。结果基因芯片检测发现共有176条基因表达发生明显改变,包括16条未知基因表达改变。其中151条基因表达上调,25条基因表达下调。根据基因功能的不同,我们初步将其分为凋亡相关、信号转导相关、细胞周期相关等几大类。定量RT-PCR验证的基因表达变化趋势与表达谱芯片的结果相吻合。结论辛伐他汀作用K562细胞后能引起多种基因表达改变,这为探讨其作用机制提供了新的依据。     

绞股蓝总皂甙对小鼠S_(180)肉瘤及K_(562)细胞的抑制作用

目的　绞股蓝总皂甙 (GP)对小鼠S180 肉瘤及K562 细胞的抑制作用。方法　通过动物实验观察绞股蓝总皂甙对小鼠S180 肉瘤生长状况、肿瘤坏死面积 (TNA)与肿瘤总面积 (TTA)的比率、瘤周瘤内免疫活性细胞浸润状况及荷瘤小鼠脾脏的影响 ;通过细胞培养观察绞股蓝总皂甙对K562 细胞生长的抑制作用。结果　经重复实验证实 ,GP能显著抑制小鼠S180 肉瘤的生长 ,TNA与TTA的比率显著增加 ,瘤周尤其是瘤内淋巴细胞、巨噬细胞浸润数量明显增加 ,荷瘤小鼠脾重增加、脾白髓数目增多、体积增大。同时证实 ,GP对K562 细胞株具有明显的生长抑制作用。结论　GP的抑瘤作用主要是直接杀伤瘤细胞 ,免疫活性细胞也发挥了一定作用     

Construction and characterization of hGM-CSF-expressing K-562 cell line

Objective The whole process of vaccine preparation is time-consuming and technically challenging. Here the hGM-CSF-engineered K-562 cell line was constructed to simplify tumor vaccine preparation process. Methods The eukaryocyte expressing plasmid pcDNA3. 1/GM-CSF was first constructed and its accuracy was verified through sequencing. The pcDNA3. 1/GM-CSF was transfected into COS-7 cells to verify GM-CSF expression and cytokine activity using TF-1 cell line. Then the plasmid was transfected into K-562 cell line using liposome method, and was selected under G-418 and sub-cloned by limiting dilution. GM-CSF product from the monoclone GM-CSF-K-562 cell lines was quantified using ELISA method. Results We successfully constructed the hGM-CSF eukaryocyte expressing plasmid and hGM-CSF expressing K-562 cell line. Conclusion The construction of K-562/GM-CSF line will simplify the preparation of tumor vaccine, thus facilitating the application of tumor vaccination therapy in clinical application.     

康莱特联合5-Fu治疗人胰腺癌PC-3裸鼠皮下移植瘤的实验研究

目的通过研究胰腺癌Bcl-2、Bax和血管内皮生长因子((VEGF)的变化情况与细胞凋亡的关系,探讨康莱特和5-Fu治疗胰腺癌的机制。方法建立人胰腺癌PC-3细胞裸鼠皮下移植瘤模型,采用免疫组织化学方法检测Bcl-2、Bax和VEGF在胰腺癌移植瘤中的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡比率,测量肿瘤体积。结果康莱特和5-Fu都可明显提高胰腺癌细胞凋亡率,降低细胞Bcl-2在蛋白水平上的表达,两者对Bax在蛋白水平上的表达无影响;康莱特明显降低移植瘤VEGF蛋白的表达;康莱特和5-Fu联合组,胰腺癌细胞凋亡比率显著高于单药组,而Bcl-2蛋白表达率显著低于单药组;康莱特和联合用药组VEGF蛋白表达率低于5-Fu组;联合用药组肿瘤体积小于单药组。结论康莱特联合5-Fu治疗胰腺癌的效果明显优于两药单独使用的效果。     

奈达铂体外诱导肺腺癌A549细胞凋亡及其作用机制

目的探讨奈达铂(NDP)体外对人肺腺癌A549细胞的影响及其作用机制。方法采用四氮甲唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的NDP对A549细胞的杀伤作用,计算半数抑制浓度(IC50);流式细胞术(FCM)测定给药前后细胞凋亡率及周期分布变化;半定量PCR分析凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达情况。结果 NDP能显著抑制A549细胞的生长;FCM结果显示,10μg/mL NDP作用A549细胞48h后,与对照组相比,细胞凋亡明显增加[(25.14±3.97)%vs.(8.01±1.46)%];S期细胞的比例增加[(52.73±1.66)%vs.(38.38±3.91)%],差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,Bax、Caspase-3、Caspase-9表达增加(P<0.05)。结论 NDP可抑制A549细胞增殖,其机制可能与诱导细胞凋亡、细胞S期阻滞及上调Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达有关。     

THE EXPRESSION OF BCL-2, BAX AND CASPASE-3 IN NEURON OF THE SPINAL CORD ANTERIOR HORN AFTER CAUDA EQUINA ACUTE COMPRESSION

Objective To explore the influence of the acute cauda equina compression on the iumbosacral spinal cord; To clarify the pathologic change of the motor neuron after acute cauda equina compression. Methods 27 canis familiaris were randomly divided into 9 groups （3 in each） ： one for normal group, one for control group, and seven for compression groups. The control group and compressed groups was given operation and the sac made of silica gel was placed under the lamina of L5-6. Water was injected into the sac until their posterior legs paralysis in compressed groups, the animals had been compressed for 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168 hours. The control group were not injected water. Cells apoptosis was investigated with the technology of TdT-mediated biotin dUTP nick end-labeling （TUNEL） staining. The Bcl-2 Bax and Caspase-3 protein was investigated by immunohistochemical method. Results TUNEL staining cells in anterior horn presented after compressed 8-12 hours, and at 72 hours the number of positive cells got to maximum, it decreased subsequently after 168 hours. The protein of Bax, Bcl-2 expressed a little in normal motor neuron. The caspase-3 protein didn＇t express in normal ceil. They all reached the peak at 72 hours after compression. Conclusion The apoptosis of motor neuron occurred earlier after eauda equina acute compression. Bax protein restrained Bcl-2 protein then active caspase-3 and conduced apoptosis of motor neuron.