PRELIMINARY STUDY OF A NOVEL HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16L1／E6-E7 CHIMERIC RECOMBINANT DNA VACCINE

Objective Preparations of HPV16 L1/E6 and L1/E7 prophylactic and therapeutic DNA vaccines. Methods The nucleotides within HPV16 E6 and E7 genes, which are responsible for viral transforming activity, were mutated by mage primer site-directed mutagenesis method. The correctly mutated E6 and E7 fragments were separately cloned into an eukaryotic expression vector pVAX1, together with HPV16 L1 gene, generating chimeric recombinants plasmids 1MpVAX1-L1E6, 2MpVAX1-L1E6, 1MpVAX1-L1E7, 2MpVAX1-L1E7 and 3MpVAX1-L1E7. CHO cells were transiently transfected with the individual DNA vaccines by calcium phosphate method. Target protein expressions in the extracts of the transfected cell lines were measured by ELISA and immunohistochemistry, with HPV16 L1 and E6 specific monoclonal antibodies. Results ELISA assays showed the P/N ratios in the cell extracts transfected with L1E6 and L1E7 plasmids were more than 2.1. Immunohistochemistry revealed brownish precipitant signal in cytoplasm and nuclei of the transfected cells. Conclusion Successful constructions of prophylactic and therapeutic DNA vaccine plasmids lay solid foundation for future animal experiment and clinical trial.     

HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L1 PROTEIN CAN BE EXPRESSED IN LIVE ATTENUATED SHIGELLA FLEXNERI 5A STRAIN SH42

Cervicalcanceristhesecondmostcommon canceramongwomenworldwide,anditaccountfor thehighestmortalityindevelopingcountries.There areabout600000newcasesdiagnosedanditcauses aboutaquartermillionwomendeathperyear[1]. Highrisktypehumanpapillomavirusinfection (suc…     

CLONING OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16 GENOME FROM CERVICAL CANCER TISSUE

Humanpapillomavirus(HPV)caninducemanybenignproliferateddiseases,forexample,lowergenitalwartsandhasacloserelationshipwithcervicalcancer.Morethan70typesofHPVhavebeenclonedandidentifiedc1J.MostofthemwereclonedintoplasmidPBR322.SinceHPVcannotproliferateinanycellcultureinvitroasyetmostHPVDNAsusedinChinacomefromabroad.InordertoconstructourHPVDNAclone,theHPV-16DNAwasisolatedfromthecervicalcancertissueandclonedasfollows.MATERIALSANDMETHODS1SpecimencollectionandtissueDNAextraction…     

运用单克隆抗体分析流感病毒H1亚型HA蛋白的抗原表位

目的对甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白的抗原表位进行分析。方法以前期获得的97株抗H1亚型HA抗原的单克隆抗体为研究工具,用间接ELISA方法对不同亚型的血凝素抗原进行反应,将H1亚型HA蛋白的抗原表位进行粗分类,用ELISA阻断试验对抗原表位进行细分类。选取两类抗原表位的抗体,通过计算机模拟分析抗体与抗原结合的结构域,推测抗体结合的具体氨基酸位点。结果根据抗体的交叉反应性不同,将流感病毒H1亚型的HA的抗原表位分为8类;根据ELISA阻断试验的初步结果,H1亚型HA抗原的抗原表位又被细分为15类,通过计算机模拟分析预测的抗体与流感病毒HA抗原结合的氨基酸位点结果与ELISA阻断试验结果相吻合。结论证明流感病毒H1N1亚型HA抗原上至少含有15个抗原表位,且通过ELISA阻断试验和计算机模拟分析得到了相互印证,为流感病毒血凝素HA抗原表位预测方法的完善及通用疫苗的研制提供了实验数据。     

真核表达人乳头瘤病毒16型L_1蛋白在检测宫颈癌患者相应抗体的应用

用真核表达HPV16L1蛋白为抗原，酶联免疫吸附测定64例宫颈癌患者血清和阴道分泌物的相应抗体，并用型特异性聚合酶键反应检测宫颈癌组织HPV16L1基因。结果：宫颈癌组血清HPV16L1抗体阳性年64．1％，对照组20．8％；宫颈癌组阴道分泌物HPV16L1抗体阳性率64.1％，对照组25％；宫颈癌组HPV16L1基因检出率为42．2％，对照组10％。有显著差异（P＜0．01）。结论：高危型HPV感染，宫颈癌患者有明显免疫反应，全身和局部无明显差异，真核表达HPV16L1蛋白可用于宫颈癌患者的抗体测定。     

女性外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的相关性

目的研究外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的关系。方法收集西安交通大学医学院第二附属医院手术治疗的44例女性外阴病变患者的临床病理资料,包括鳞癌11例,鳞状上皮内瘤变(VIN)10例,尖锐湿疣9例及白色病变14例。采用免疫组化SP方法检测HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白的表达。结果①4组外阴病变患者年龄中位数依次为:外阴鳞癌61岁、VIN 45.5岁、尖锐湿疣24岁、外阴白色病44岁,尖锐湿疣组中位年龄低于外阴鳞癌组及白色病变组(P<0.05),其余各组间中位年龄无统计学差异。②HPV16/18E6蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组及外阴鳞癌组的阳性率分别为2/14、3/9、3/10、8/11,外阴鳞癌组高于白色病变组(P<0.05),其余各组间无统计学差异;HPV6L1蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组、外阴鳞癌组的阳性率分别为1/14、8/9、4/10、3/11,尖锐湿疣组高于其他各外阴病变组(P<0.05),其余各组间比较差异无统计学意义。③HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白在早期外阴鳞癌的阳性率均高于中晚期(P<0.05);HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白表达均与外阴鳞癌的组织学分级、年龄分组、绝经情况、产次不相关(P>0.05);HPV16/18E6蛋白与HPV6L1蛋白在外阴鳞癌中的表达不相关(P>0.05)。结论外阴病变的发病与年龄及HPV16/18、HPV6感染有关;外阴鳞癌中HPV16/18、HPV6的感染率与FIGO分期有关,HPV16/18感染率与HPV6的感染率无关。     

THE HUMORAL AND CELLULAR IMMUNE RESPONSES INDUCED BY HPV18L1-E6/E7 DNA VACCINES IN MICE

Objective To construct eukaryutic expression vector of HPV18 L1- E6, E7 chimeric gene and examine the humorul and cellular immune responses induced by this DNA vaccines in mice. Methods The C-terminal of major rapsid protein L1 gene and mutant zinc finger domains of early E6/7 oncogenes in HPV18 were integrated and inserted into eukaryotic expression vector pVAX1 to generate vaccines pVAX1-L1E6Mxx, ETMxx. CHO cells were transiently transfected with the individual construct. Target protein expressions in the lysate of the transfected cells were measured by ELISA and immunocytochemistry After BALB/c mice were vaccinated with various recombinant plusmids（pVAX1- L1-E6M3 or pVAX1-L1-E7M3 ） and immunie adjuvants （pLXHDmB7-2 or LTB） through different administration routes （intramuscular or intranasal） , the great cellular immune responses were produced us revealed by delayed-type hypersensitivity （DTH） and lymphocyte proliferation, and the expression of IL-4 and IFN- 7 cells in CD4^＋ and CD8^＋ subpopulations. Results The highly efficient expression of pVAX1-L1E6Mxx, E7Mxx vector in host eukaryotic cells were demonstrated both by ELISA and immunocytochemistry. The level of specific serum IgG against HPV in experiment groups mice was much higher than that of control group, and intranuscular immunization group had the highest antibody level. Intramuscular immunization groups were superior to intranasal immunization groups in DTH response, splenocyte proliferation and CD8^＋ IFN-γ^＋ cells number, but CD4^＋ IL4^＋ cell number was higher in intranasul immunization groups. The immunization groups using pLXHDmB7.-2 as adjuvant were superior to other groups in immunorespouse. Conclusion These DNA vaccines produce remarkable cellular and humorul immune responses in the mouse and may provide us prophylatic and therapeutic candidates for HPV induced cancer treatment.     

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的　分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法　采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果　成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。结论　中国人宫颈癌HPV16E6基因结构有一定的变异     

子宫颈癌患者HPV16 E6,E7血清抗体检测

通过基因工程技术制备HPV16 E6,E7抗原,用免疫酶联吸附法检测了44例子宫颈癌病人和20例健康献血员血清HPV16 E6,E7抗体。结果表明,健康人血清HPV16 E6和HPV16 E7抗体阳性者分别占35％(7/20)和20％(4/20)。病人血清中,HPV16 E6抗体阳性率68.18％(30/44),但其反应滴度均值与健康人无显著差异。HPV16 E7抗体阳性率为58.18％(25/44),其阳性率及反应滴度均明显高于健康人。这提示,HPV16 E6抗体可能并非HPV16的型特异性抗体,而HPV16 E7抗体则有可能成为子宫颈癌发生的预报信号。     

THE DETECTION OF HPV16E6，E7 GENES IN TISSUES AND THEIR ANTIBODIES IN THE SERA OF PATIENTS WITH CERVICAL CARCINOMA

ＴＨＥＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＨＰＶ１６Ｅ６，Ｅ７ＧＥＮＥＳＩＮＴＩＳＳＵＥＳ　ＡＮＤＴＨＥＩＲ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＩＮＴＨＥＳＥＲＡＯＦＰＡＴＩＥＮＴＳＷＩＴＨ　ＣＥＲＶＩＣＡＬＣＡＲＣＩＮＯＭＡＬｉｕＴｉａｎｊｕ；ＬｉｕＨｕａ；，ＳｕｎＹｉ；，Ｓ...     

用分子杂交法探讨HSV、HPV与宫颈癌的相关性

宫颈癌的流行病学特点提示癌的发生与感染因素有关。主要涉及两组病毒:单纯疱疹病毒(HSV)和人乳头瘤病毒(HPV)。为了探讨HSV、HPV 与宫颈癌的关系,我们以~(32)P 标记HSV—2DNA 和HPV DNA,分别用Southern 转印和打点杂交技术,同时检测了73例宫颈癌和14例正常宫颈活检标本。在严格状态下杂交,65例宫颈癌中未发现HSV—2DNA,其中19例癌组织RNA 与HSV—2DNA 杂交阳性。研究发现与宫颈癌组织RNA 杂交阳性的HSV—2DNA 位于0.2～0.33,0.58～0.625图谱单位。此外,在25例宫颈癌中检出了HPV_(16) DNA,2例标本检出了HPV_(18) DNA。在非严格状态下杂交,8例经PstⅠ酶切的宫颈癌组织DNA,Southern 转印后分别与HPV_(16) DNA 和HSV—2BglⅡ克隆片段杂交。结果,6例检出了HPV_(16)DNA,1例既检出了HPV_(16)DNA,又检出了HSV—2DNA。初步结果说明HPV、HSV—2与宫颈癌的发生可能有关。     

β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备

目的　制备稳定分泌β -淀粉样肽 1～ 4 2 (Aβ1-42 )单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,产生高效价抗体。方法　通过基因工程技术 ,将Aβ1-42 基因融合于乙肝核心抗原 (HBcAg)的主要免疫优势区 (MIR) ,制备Aβ和HBcAg的融合蛋白 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0细胞融合 ,筛选能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果　得到两株能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,Aβ1-42 单克隆抗体的Ig亚类为IgG3 。结论　制备得到的Aβ1-42 单克隆抗体特异性强 ,效价高     

TDI-FP法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16、18型别感染

目的通过模板介导的染料终止子掺入-荧光偏振技术(TDI-FP)检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16、18感染情况,以初步探讨本地区HPV流行特点。方法基于TDI-FP的基本原理,以HPV16、18 L1克隆重组质粒为模板,用HPV通用引物GP5+/6+PCR扩增,再通过检测探针杂交后掺入的特异荧光素标记碱基的不同来判断病毒的类型。结果在宫颈癌组织中HPV16和18型阳性率分别为61.8%及32.7%,高危型HPV占宫颈癌HPV的98.1%,宫颈癌组高危型HPV阳性率显著高于癌前病变组和慢性宫颈炎组。结论初步提示宫颈癌患者HPV感染以高危型为主,其中有超过一半的患者以HPV16型感染为主。TDI-FP是一新兴的高通量基因检测技术,快速、可靠、敏感、特异并且操作简便,更适合于大规模临床筛查及在临床上广泛推广应用。     

维吾尔族妇女宫颈癌组织中p16蛋白与HPV16/18的相关性

目的探讨在维吾尔族妇女宫颈癌组织中p16蛋白的表达和HPV(16/18型)感染的关系。方法采用免疫组化S-P法和聚合酶链反应(PCR)技术检测34例正常宫颈组织(汉族19例,维吾尔族15例)以及40例宫颈癌组织(汉族18例,维吾尔族22例)中p16蛋白的表达和HPV16/18的感染情况。结果维吾尔族宫颈癌及正常宫颈组织中p16蛋白的阳性表达率与汉族相比均无统计学差异(P>0.05);维吾尔族、汉族宫颈癌中p16蛋白的阳性表达率(97.50%)明显高于维吾尔族、汉族正常宫颈组织(2.94%)(P<0.05)。HPV16型感染的宫颈癌中维吾尔族阳性表达率(54.54%)高于汉族(22.22%)(P<0.05);但HPV18型感染的宫颈癌无统计学意义(P>0.05)。维、汉宫颈癌组织中p16蛋白表达量与HPV16型感染的相对表达量呈显著正相关性(r=0.603,P<0.05)。结论p16蛋白和HPV联合检测可能作为检查宫颈癌的标记物,提高宫颈癌的检出率。     

应用PCR技术克隆人乳头瘤病毒16型E6基因

为进一步研究与宫颈癌发生密切相关的人乳头瘤病毒16型E6基因的转化作用,我们运用PCR技术扩增HPV16 E6 DNA,以pUC—19为载体,大肠杆菌了JM103为宿主菌,组建了质粒pRCE6经限制性核酸内切酶和Southern转印杂交证实,其插入片段约为0.5Kb,含有全部HPV16 E6序列。该质粒的组建为检测HPV感染中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针。同时为进一步研究HPV16 E6基因的转化作用及转化蛋白打下基础。     

体外诱导人脐血CD34~+细胞向肝细胞的分化

目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50 mL/L FBS,1×ITS,4.7 mg/L亚油酸,10-4mol/L 2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16 d时留取细胞。通过RT-PCR对ALB、AFP、GATA-4等mRNA的表达水平进行检测;用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达,并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%,达到分离要求。RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16 d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞,ELISA检测表明诱导组8、16 d培养液中的ALB质量浓度明显增高,与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论在体外培养条件下,脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。     

THE CONSTRUCTION OF LEUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID PCDNA3/HPV16E6 AND EXPERIMENTAL OBSERVATION OF NAKED DNA INJECTED INTO ANIMAL

Cervicalcancerisacommonmalignancyofmarriedwomen.HighriskHPV(HPV16,18)infectioniscloselyassociatedwithcervicalcancer(l).HPV16DNAcanbedetectedinapproximately50%~90?rvicalcarcinomastZ).HPV16E6andE7geneshasbeenprovedtobetransforminggenes.TheirgeneproductscanbindtoandinactivateP53andPRbrespectively,playingacausalroleinthedevelopmentofcervicalcarcinomat27.AlotofinvestigationindicatethatHPV16E6/E7wereconsistentlyandhighlyexpressedincervicalcarcinomas,andthatE6/E7proteinscouldinducebothhu…     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步免疫观察

目的　构建用于防治单纯疱疹的核酸疫苗并观察其免疫效果。方法　用PCR反应 ,从HSV 1F株基因组DNA中扩增出 gD蛋白的全部编码序列 ,将其插入 pcDNA 3 1 (+)的PCMV下游 ,构建HSVgD核酸疫苗 ,并用酶切分析和测序鉴定 ;通过中和试验、ELISA方法和攻击试验检测用 pLy D三次肌肉接种小鼠的免疫效果。结果　经鉴定证实了HSV gD核酸疫苗 pLy D的构建 ;实验小鼠产生了对HSV 1特异性的抗体 (抗体滴度 :ELISA法 1∶2 0 3,中和试验法 1∶37) ,并经受了HSV 1病毒的攻击 (存活率 :70 % )。结论　成功构建出了HSV gD核酸疫苗pLy D ,用其接种小鼠可以诱导产生特异性免疫反应 ,并具有良好的保护作用。     

人子宫颈癌中的HPV_(16)E_6mRNA、p~(53)、P~(21)~(ras)和c-myc蛋白表达

为进一步探讨子宫颈癌的分子发病机制，采用PCR、ISH和IHC方法对51例子宫颈癌组织的HPV16感染、HPV16E6mRNA、p53、p21ras和c－myc蛋白表达分布进行了研究。结果表明51例中有HPV16感染者38例，HPV16E6mRNA表达者35例，其阳性细胞主要分布在高分化癌巢之周边部或中、低分化癌之整个癌巢；p53、p21ras和c－myc蛋白阳性检出率分别为33．3％、60．8％和76．5％，其阳性细胞是弥漫或灶状分布。统计分析表明HPV16感染与P53、P21ras、c－myc蛋白积累间无关，但后三者间则显著相关。这提示癌基因活化或抗癌基因的失活及HPV16感染等因素之协同在子宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

分子杂交法检测女性尖锐湿疣中的人乳头瘤病毒DNA

本研究以~(32)P标记的重组HPV 11,16,18质粒为探针,采用打点杂交法检测了60例女性尖锐湿疣组织(其中外阴47例,阴道12例、宫颈1例)中的HPVDNA;用限制性内切酶和Southern转印杂交法分析了8例HPV 11 DNA的物理状态。结果检出HPV11 19例,其中外阴13例,阴道5例,宫颈1例,阳性率31.7%;HPV16,18各1例,分别检自阴道和外阴,阳性率均为1.7%;HPV 11均以游离状态存在。这一结果为国内进一步深入研究HPV与生殖器癌之间的关系提供了资料。