逆转录病毒介导CXCR4-siRNA对前列腺癌细胞体外侵袭能力的影响

目的设计构建趋化因子受体4(CXCR4)的RNA干扰逆转录病毒载体,探讨干扰CXCR4表达对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。方法用PCR扩增CXCR4特异性小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的Pgensil-1质粒中,再将重组基因片段导入到逆转录病毒真核表达载体PLX-SN中,行限制性酶切及测序鉴定。重组逆转录病毒载体转染包装细胞PA317,获取病毒上清转染前列腺癌细胞,RT-PCR检测CXCR4mRNA表达。Transwell小室侵袭实验检测前列腺癌细胞体外侵袭能力的变化。结果通过酶切及测序鉴定,成功构建了PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4。干扰质粒抑制CXCR4mRNA的表达,与空载体组比较,PC-3m、LNCaPsiRNA对CXCR4mRNA的抑制率分别为(84.26±10.20)%和(88.17±11.23)%。Transwell侵袭实验结果显示,干扰组微膜下孔细胞数PC-3m、LNCaP分别为(14.7±3.1)和(18.9±4.2)个,空载体组分别为(46.9±5.3)和(66.7±6.0)个,两者差异显著(P<0.05)。结论PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4可以有效地抑制前列腺癌细胞CXCR4mRNA的表达,干扰CXCR4可以显著抑制前列腺癌细胞体外侵袭转移能力。     

表达US3基因腺病毒载体下调CTL和NK细胞对其转染肝细胞杀伤活性的影响

目的研究表达US3基因重组腺病毒载体对其转染肝细胞介导的免疫逃逸活性。方法首先构建表达US3基因腺病毒载体,扩增纯化后转染HL-7702肝细胞,利用细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验和自然杀伤细胞(NK)杀伤实验,检测表达US3基因重组腺病毒载体的免疫活性。结果表达US3基因的重组腺病毒r-US3成功构建,r-US3能够明显降低CTL和NK细胞对转染肝细胞的杀伤活性。结论表达US3基因腺病毒载体在一定程度上能够介导转染肝细胞的免疫逃逸,降低机体免疫系统对转染肝细胞的排斥反应。     

T_3核受体各亚型mRNA在不同甲状腺功能患者外周血白细胞中的表达

目的　T3对细胞的代谢调节作用是通过甲状腺激素核受体 (T3R)介导的 ,细胞中T3R量与细胞对T3的反应性有关。本文探讨了T3R表达与人体不同甲功状态的关系。方法　应用半定量RT PCR法 ,研究了Graves 甲亢、桥本甲炎甲功正常、桥本甲炎甲减患者外周血白细胞中T3R各亚型mRNA表达量的变化 ,并与正常对照进行比较。结果　外周血白细胞中T3Rα1 、T3Rα2 、T3Rβ2 mRNA表达在Graves 甲亢患者降低 ,在桥本甲炎甲减患者升高 ,而桥本甲炎甲功正常者有升高倾向 ;T3Rβ1 mRNA在不同甲功状态中变化不大。结论　在外周血白细胞中 ,T3RmRNA各亚型表达与甲功状态密切相关 ,T3对其受体亚型mRNA表达水平有下调作用 ,但T3Rβ1 mRNA表达不受甲功状态影响。     

青春期大鼠实验性精索静脉曲张对附睾雄激素受体的影响

目的　研究实验性左侧精索静脉曲张(ELV)对附睾雄激素受体的影响。方法　建立青春期大鼠 ELV模型,通过免疫组化及蛋白印迹方法,研究ELV 4周组、8周组与正常对照组附睾雄激素受体表达之间的差异。结果　雄激素受体分布于附睾管各段上皮的细胞核内,ELV 4 周组附睾内雄激素受体的表达比 4 周正常对照组明显增强(P<0.01),而ELV 8周组附睾内雄激素受体表达比ELV 4周组及8周正常对照组均减弱(P<0.01),同组左右侧附睾间未见雄激素受体表达有明显差异(P>0.05)。结论　青春期大鼠ELV可导致雄激素受体表达异常,这可能是造成不育或生育力低下的原因之一。     

黄芩苷对人牙周膜细胞RANKL-OPG表达的影响及其作用机制

目的 研究黄芩苷对人牙周膜细胞核因子-κB受体激活物配基和骨保护素(RANKL-OPG)表达的影响及其作用机制.方法 首先构建转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βⅡR)靶向siRNA真核表达载体,转染正常人外周血T细胞,使T细胞表面的TGF-βⅡR基因沉默,继而将转染与未转染靶向性TGF-βⅡR基因沉默的T细胞和正常人牙周膜成纤维细胞置于加有黄芩苷和内毒素的培养基中,分为6组:①正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;②正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;③正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;④正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;⑤正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;⑥正常牙周膜成纤维细胞.共培养48h,RT-PCR检测牙周膜细胞RANKL和OPG的表达,计算RANKL/OPG比值.结果 ①酶切鉴定正确的克隆测序结果与设计的目的 序列完全一致;②转染siRNA1的T细胞组的TGF-βⅡR mRNA的表达被明显抑制;③RANKL/OPG的比值在各组间的差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建了TGF-βⅡR靶向siRNA真核表达载体并成功转染T细胞;黄芩苷可以降低牙周膜细胞表面RANKL/OPG比值;TGF-β的信号传导在黄芩苷影响牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG表达过程中起着重要作用;黄芩苷并非只通过TGF-β信号传导通路,而是亦通过其他通路对牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG进行调控.     

人脑源性神经营养因子重组腺伴随病毒的制备

目的　构建并产生人脑源性神经营养因子 (humanbrain derivedneurotrophicfactor ,hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno associatedvirus,AAV)载体。方法　将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG Neo的EcoRI BamHI位点 ,构建重组质粒pSSHG Neo/hBDNF。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的重组质粒 ,三质粒磷酸钙共沉淀法转染 80 %融合的 14 3细胞系 ,包装AAV hBDNF。经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　重组病毒AAV hBDNF滴度约为 4 .86× 10 14 颗粒·L-1。结论　成功制备了重组病毒AAV hBDNF ,为神经退行性疾病基因治疗实验奠定了基础     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

雄激素受体在大鼠睾丸发育过程中的表达及雄激素对其表达的调节作用

目的　研究发育不同阶段及二甲磺酸乙烷 (EDS)干预的雄性SD大鼠睾丸内雄激素受体 (Androgenreceptor,AR)的分布、发育模式及雄激素调控。 方法　采用免疫组织化学ABC法 ,并应用图像分析测定AR的视物平均光密度 ,以其表示核内AR相对含量。结果　特异性AR免疫染色见于睾丸间质细胞、肌样细胞、支持细胞、精原细胞、血管壁平滑肌细胞及内皮细胞。间质细胞中AR相对含量随大鼠年龄而变化 :2 1d龄居中 ,35d龄最高 ,90～ 1 2 0d龄最低 ,各组间均有显著性差异 (P <0 .0 5或P <0 .0 1 )。肌样细胞在 3个年龄组大鼠均有很强的AR表达。应用EDS消除成年大鼠内源性睾酮后 ,睾丸内所有AR阳性细胞的免疫染色均显著减弱 ,外源性睾酮替代治疗后免疫染色程度可恢复至对照组水平。结论　雄激素可促进青春期大鼠间质细胞的功能与分化 ;肌样细胞在精子发生过程中有重要作用 ;睾丸内AR的表达受内源性睾酮的调控。     

IL-23受体在炎症性肠病患者外周血淋巴细胞中的表达及意义

目的 检测炎症性肠病(IBD)即溃疡性结肠炎(UC)及克罗恩病(CD)患者外周血淋巴细胞表面白介素-23(IL-23)受体的表达情况,并讨论其在疾病发生中的意义.方法 收集30例UC患者、16例CD患者和30例正常对照者的外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),采用三色流式细胞术检测IBD患者外周血CD4+T、CD8+T和CD56+NK细胞表面IL-23受体(IL-23R)的表达,并与正常外周血比较.结果 UC及CD患者外周血中CD4+T、CD8+T、CD56+NK细胞表面IL-23R的表达明显高于对照组(P＜0.05).结论 IBD患者外周血淋巴细胞表面IL-23R的表达增高,提示IL-23R在IBD的发病过程中起重要作用.     

SLC-Her-2/neu-p53-Fc融合基因重组腺病毒真核表达载体对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果

目的扩增纯化携带融合基因SLC-Her-2/neu-p53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体,研究其对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果。方法将重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc在人胚肾293细胞中扩增、纯化;向小鼠皮下注射表达Her-2/neu-p53融合基因的B16F10-psig-Her-2/neu-p53细胞(B16-HP细胞)建立荷黑色素瘤小鼠模型;将小鼠随机分成对照组、肌肉注射组和皮下注射组,用重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体进行治疗,观察肿瘤生长情况,测定细胞毒性活性、血清p53抗体。结果纯化后重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体滴度8×108pfu/mL。目的基因SLC-HP在小鼠体内成功表达。重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能有效抑制小鼠肿瘤的生长,瘤重与对照组比较差异有统计学意义(P=0.005),抑瘤率达到98.8%,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤力有明显提高。结论重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能延长出瘤时间,抑制肿瘤的生长。     

EXPRESSION OF ANDROGEN RECEPTOR IN THE DEVELOPING RAT EPIDIDYMIS AND ITS REGULATION BY ANDROGENS

Epididymis depends upon androgens for itsprenatal and postnatal differentiation,absorptionof testicular fluid,transport of sperm,and secre-tion of proteins thatbring aboutfunctional changesin sperm[1] .Because of the significance of andro-gens in epididymis- mediated sperm maturation,weassessed the localization,developmental patterns,and hormonal control of androgen receptors(AR)in the developing and ethane dimethane sulfonate(EDS) treated SD rat epididymis(caput,corpusand cauda) .The immuno…     

A STUDY ON EXPRESSION OF ARmRNA IN HUMEN BPH TISSUE WITH IN SITU RT-PCR

Ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅｉｓｔｈｅｍａｉｎｔａｒｇｅｔｏｒｇａｎｏｆａｎｄｒｏｇｅｎ .Ａｂｎｏｒｍａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｄｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ (ＡＲ )ｗｉｌｌｄｉｒｅｃｔｌｙａｆｆｅｃｔｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｎｇａｃｔｉｏｎｏｆａｎｄｒｏｇｅｎｏｎｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ,ａｎｄｐｒｏｂａｂｌｙｒｅｓｕｌｔｉｎｂｅｎｉｇｎｐｒｏｓｔａｔｅｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ (ＢＰＨ )ａｎｄｐｒｏｓｔａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ (ＰＣ) [1,2 ] .Ｔｏｐｒｏｂｅｉｎｔｏｔｈｅｒ…     

大鼠心肌组织中雄激素受体的免疫组化研究

目的 观察增龄和性腺发育对雄性大鼠心肌组织中雄激素受体密度的影响。方法 采用免疫组织化学和图像分析法检查性成熟前、成年去性腺、成年和老龄雄性大鼠心肌组织中雄激素受体密度，观察增龄及性腺对雄性大鼠心肌组织中雄激素受体密度的影响。结果 去性腺成年组心肌组织中雄激素受体的免疫反应性最高，其次为老龄组，二者均高于性成熟前组和正常成年组，后2组无显著性差异。结论 性成熟前后性腺发育对雄鼠心肌组织中雄激素受体的密度无明显影响，老龄及去性腺均使雄鼠心肌组织中的雄激素受体密度显著增高。     

良性前列腺增生的形态学改变与ARmRNA表达差异

采用直接法原位ＰＣＲ技术对４例ＮＡＰ和１０例ＢＰＨ组织中ＡＲｍＲＮＡ表达作了检测分析，并对其在ＮＡＰ与ＢＰＨ的表达作了定量比较分析。结果表明∶（１）ＮＡＰ及ＢＰＨ标本ＡＲｍＲＮＡ表达均显示阳性。阳性信号主要定位于靠近核膜的胞浆当中，主要分布在前列腺上皮细胞、间质细胞。（２）前列腺上皮组织中ＡＲｍＲＮＡ表达具区域异质性的特点；部分增生前列腺的腺上皮基底层（ＢＣＬ）细胞阳性表达增强，ＮＡＰ组未发现此现象。（３）图像分析表明无论是ＮＡＰ还是ＢＰＨ，ＡＲｍＲＮＡ在腺上皮的阳性表达强度均强于间质。而ＮＡＰ与ＢＰＨ之间阳性表达强度无显著差异。     

~(188)Re作用于三种肿瘤细胞株的剂量-效应关系及敏感性研究

目的　研究放射性核素1 88Re作用于不同肿瘤细胞株的剂量 效应关系及药物敏感性。方法　采用MTT法观察1 88Re作用于前列腺癌PC 3细胞、乳腺癌ER 75 30细胞和非小细胞肺癌A5 4 9细胞后各细胞株生长受抑制的程度并绘制抑制率曲线。结果　PC 3、ER 75 30、A5 4 9细胞加入1 88Re 48h后 ,细胞形态发生变化 ,表现为形态不规则 ,贴壁能力下降 ,透光度降低 ,部分细胞崩解死亡 ,且效应随着药物浓度的增加更为明显。在同一剂量下抑制率为PC 3>ER 75 30 >A 5 4 9。对1 88Re的敏感性PC 3最敏感 ,ER 75 30细胞次之 ,A5 4 9细胞相对较差。结论　1 88Re对肿瘤细胞的生长具有抑制作用 ,不同肿瘤细胞对1 88Re的敏感性不同     

多囊卵巢综合征患者肾素血管紧张素与雄激素及胰岛素抵抗的相关性

目的探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者肾素血管紧张素与雄激素及胰岛素抵抗的相关性。方法选择PCOS患者和正常对照组妇女各40例,检测血浆肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、胰岛素、血糖和性激素水平。结果①F-G评分、LH/FSH比值、T、PRA和AngⅡ浓度,空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(Homa IR)、胰岛素分泌指数(Homaβ)显示,PCOS组>对照组(P<0.05);②PCOS组PRA与月经周期、AngⅡ、LH/FSH、T、FINS、Homa IR、Homaβ、β细胞功能评定指数(MBCI)呈正相关性(分别为r=0.40,0.44,0.37,0.35,0.50,0.42,0.48,0.38,P<0.05);AngⅡ与月经周期、LH/FSH比值、T呈正相关(分别r=0.34,0.32,0.42,P<0.05);AngⅡ与FSH呈负相关(r=-0.36,P<0.05)。结论①多囊卵巢综合征存在肾素-血管紧张素-雄激素级联亢进;②RAS亢进可能参与PCOS胰岛素抵抗和生育障碍的发生。     

Eukaryotic expression and biological activity analysis of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin

Objective To investigate the expression of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin (HNG) in eukaryotic cells by gene engineering technique and analyze its biological activity. Methods By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of HNG with FLAG in its C-terminal was obtained, which was cloned into the plasmid pcDNA3.1(-), and the resultant recombinant vector pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was transfected into PC12 cells. At the same time, the recombinant vector pcDNA3.1(-)/EGFP was transfected to control the efficiency of transfection. The expression of HNG in the cells was determined by immunocytochemistry. In order to analyze the biological activity of the expressed HNG, 25μM Aβ25-35 peptide was added to the culture medium of the transfected cells for 24h, then cell morphology, MTT assay and Hoechst 33258 staining were observed. Results The eukaryotic expression vector of pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was identified by enzyme digestion and sequencing. HNG was highly expressed in PC12 cells. After exposure of PC12 cells to 25μM Aβ25-35 for 24h, cell viability decreased to (65.8±5.3)%, and the dystrophic changes of neuritis and nuclei condensation were obvious. When cells were pre-transfected with pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG, Aβ25-35-induced cell death and morphological changes of cells and nuclei were suppressed. In contrast, pre-transfected with empty vector did not protect cells from Aβ25-35-induced toxicity. Conclusion The eukaryotic expression vector for FLAG-tagged HNG was successfully constructed and expressed in PC12 cells. Expressed HNG has biological activity.