ChABC、GDNF、Nogo-A抗体联合应用促损伤脊髓再生修复的实验研究

目的探讨ChABC、GDNF及Nogo-A抗体联合应用对大鼠脊髓完全性横断伤后脊髓再生修复及功能恢复的影响。方法采用大鼠胸段(T7~8)脊髓完全横切损伤模型,将SD大鼠随机分为6组:正常对照组、单纯横断组、ChABC(A组)、GDNF(G组)、Nogo-A抗体(N组)、ChABC+GDNF+Nogo-A抗体(AGN组)。于24周取材,行BDA示踪、NF-200、GAP-43、GFAP免疫组化染色。结果 A组、G组、N组BDA示踪染色,光镜下可见损伤区近侧端蓝色的示踪颗粒较多,损伤区很少有蓝色的再生神经纤维;AGN组可见蓝色的神经纤维通过损伤区并出现在损伤区的远侧段,损伤区中央为空泡样变,周围可见蓝染的纤维。NF-200免疫组化染色可见,A组、AGN治疗组NF阳性染色强于正常对照组及单纯横断组(P<0.05),AGN组较G组、N组显著增强(P<0.05)。A组、AGN治疗组GAP-43阳性染色强于正常对照组及单纯横断组(P<0.05),AGN组较A、G、N组显著增强(P<0.05)。正常对照组及单纯横断组GFAP阳性染色强于各治疗组(P<0.05),A组、G组、N组与AGN组比较未见统计学差异(P>0.05)。仅正常对照及AGN组可记录到SEP,但AGN组较对照组SEP潜伏期有所延长。结论 ChABC、GDNF、抗Nogo-A抗体单独或联合应用,能改善脊髓损伤区及两段的神经细胞功能,联合应用对脊髓再生修复优于各单一治疗组。     

周围神经端侧吻合实验研究

目的　探讨神经外膜、束膜开窗神经端侧吻合术在修复周围神经缺损的可行性。方法　将 15只SD大鼠一侧腓总神经切断 ,在胫神经外膜开 1mm小窗 ,将腓总神经远端吻合到胫神经开窗处 ,将腓总神经近端吻合到股外侧肌肉内。对侧肢体作实验对照。术后 3月在全麻下行电生理测试神经冲动传导速度。取端侧吻合口部以远近胫神经、腓总神经及端侧吻合口部神经组织行光镜、电镜观察。结果　发现神经冲动能够通过端侧神经吻合处传播 ,神经传导速度比对照侧神经传导速度慢 ,有明显差异 (P <0 .0 5 )。光镜下吻合口处可见到胫神经发出侧芽。侧芽与胫神经伴行一段距离后 ,分叉离开胫神经 ,进入腓总神经。再生纤维主要为细小的有髓神经纤维。再生神经纤维及髓鞘面积显著小于正常腓总神经。电镜示再生纤维主要为细小的有髓神经纤维。结论　神经端侧吻合后 ,供体神经干可发出侧芽长入受损的神经干 ,侧支再生神经纤维主要为细小的有髓纤维 ,但质量较差。吻合后供体神经不受影响。     

弥漫性轴索损伤后胶质反应及生化标记物的研究进展

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)后胶质反应与继发性轴索损伤、轴突再生及患者的预后密切相关,而且DAI后一些特异性生化标志物可以发生明显的变化。目前的研究表明,DAI后胶质细胞既能通过胶质瘢痕形成、炎症反应、髓鞘丢失等多种机制参与DAI后继发性损伤的发生,又能通过释放神经营养因子、清除细胞碎片、阻止病损蔓延等促进轴突修复和再生,胶质细胞之间、胶质细胞与神经元之间的相互作用是最终导致DAI后神经元死亡以及轴突继发性断裂的主要原因;DAI后β淀粉样蛋白、神经微丝和微管相关蛋白等特异性生化指标能更早期、更准确地显示DAI的发生与发展,将弥补影像学及临床特征诊断的不足。这些研究不但为DAI后神经保护及轴突再生提供治疗靶点,也为进一步研究并寻找新的DAI相关生化标记物提供理论依据。进一步阐明DAI后胶质细胞激活、胶质细胞与神经元相互作用、胶质细胞之间相互作用的相关分子机制及其复杂的病理生理过程,以及深入揭示DAI相关生化标志物的意义,对减轻DAI后脑损伤、促进轴突再生、提高DAI诊断及治疗水平具有重要意义。     

白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后炎症反应的影响

目的探讨白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后炎症反应的影响。方法 63只SD大鼠随机分为假手术组、损伤组、白藜芦醇处理组,每组21只。假手术组仅行手术暴露,不给予打击及治疗;损伤组采用Allens打击法建立SD大鼠脊髓损伤模型;白藜芦醇组模型建立后给予白藜芦醇200mg/kg腹腔注射。术后24、48、72h采用ELISA法检测各组脊髓组织白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;比色法测定髓过氧化物酶(MPO)活性;免疫组化及Western blot法检测术后72h脊髓组织IL-1β、IL-10、TNF-α、MPO蛋白表达的变化。结果 24、48、72h各时间点白藜芦醇组较损伤组IL-1β、IL-10、TNF-α表达及MPO活性降低(P<0.05);72h免疫组化染色及Western blot检测显示,白藜芦醇组较损伤组TNF-α、IL-1β、IL-10及MPO的表达明显降低(P<0.05)。结论白藜芦醇可通过降低大鼠脊髓损伤后脊髓组织中炎性介质活性发挥对脊髓损伤的保护作用。     

大鼠急性脊髓损伤中caspase-1的表达及意义

目的研究半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific protease-1,caspase-1)在大鼠急性脊髓损伤后的表达及意义。方法取健康成熟SD大鼠36只,随机分为对照组和损伤组,各18只,每组再分8 h、3 d7、d共3个时间点,每个时间点6只。对照组仅做单纯T8、T9椎板切除术,损伤组则按Nystrom法建立大鼠急性脊髓损伤动物模型。HE染色观察脊髓组织病理学变化,免疫组化测定各时间点caspase-1的表达变化。结果对照组大鼠脊髓组织中少量细胞caspase-1表达阳性。脊髓损伤后8 h时,损伤组caspase-1表达高于对照组,3 d时表达最高,7 d时略有降低,但仍高于对照组。脊髓损伤组各时间点caspase-1表达阳性细胞数较对照组明显升高(P<0.01)。结论大鼠脊髓损伤后caspase-1的表达迅速增强,可能是导致脊髓继发性损伤的因素之一。     

PARP-1在大鼠弥漫性轴突损伤脑组织中的表达及意义

目的探讨多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP-1)在大鼠弥漫性轴突损伤(DAI)脑组织中的表达变化及意义。方法健康成年雄性SD大鼠36只,随机分为6组:正常对照组、DAI后30min组、DAI后6h组、DAI后12h组、DAI后24h组、DAI后7d组,每组各6只。采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置制作DAI模型。在预定时间点取大脑皮质、脑干进行HE染色、银染及PARP-1免疫组织化学染色,采用阳性细胞计数法进行半定量统计,用单因素方差分析和SNK-q检验进行统计学处理。结果光镜下银染可见大鼠DAI后脑皮质及脑干存在轴突回缩球,HE染色可见不同程度的轴突肿胀、神经细胞核固缩、血管内皮细胞肿胀、血管周间隙增大。上述形态改变在DAI后12h至24h达到高峰。PARP-1在正常对照组脑皮质、脑干的神经元及神经胶质细胞的细胞核内有少量阳性表达。在DAI组的神经元及神经胶质细胞,以胞核阳性表达为主,同时存在胞质阳性表达。DAI后30min时脑皮质及脑干阳性细胞数明显增加,12h达到高峰,24h开始下降,到7d时脑皮质阳性细胞数仍高于正常水平(P<0.05),脑干阳性细胞数与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PARP-1在DAI后皮质与脑干呈明显规律性表达;其变化规律与皮质和脑干的结构变化呈同步性动态改变;PARP-1可能在DAI后的继发性脑损伤中起重要作用。     

大脑皮层下轴突纤维横断模型的建立

目的　建立一种机械性大脑皮层下轴突纤维横断动物模型。方法　对 1 0例正常 2 1 0～2 4 0 g雄性SD大鼠的大脑皮层厚度和第V层神经元深度进行测定。根据测定结果决定三组不同的横切深度 (每组用SD大鼠 8只 )。在立体定位下进行脑皮层下轴突纤维横断 ,观察动物术后肢体功能恢复情况。 1 7d后取脑进行切片和染色 ,对横切深度进行测量 ,并对神经元和神经纤维状况进行观察。结果　正常 2 1 0～ 2 4 0g雄性SD大鼠大脑皮层厚度为 ( 1 85± 0 1 2 )mm ;第V层神经元深度为 ( 1 1 7± 0 0 5 )mm。对同一预定深度所获的实际深度之间最大相差 1 60 μm。三个损伤组实际深度与预定深度差值的绝对值 |d|分别为 ( 5 0 1 7± 2 6 2 0 ) μm、( 4 6 68± 32 84)μm和 ( 4 8 70± 2 9 76) μm ,最大 |d|值为 90 μm。在损伤深度分别为 2 0 0 μm、40 0 μm和 60 0 μm时 ,神经元存活率分别为 ( 4 2 5 5± 5 1 0 ) %、( 68 96± 5 2 1 ) %和 ( 74 5 2± 5 37) %。结论　该模型模拟了多种脑白质病变导致轴突损伤的共同特征 ,重复性好 ,是进行脑轴突损伤后神经修复与再生研究较理想的模型。     

电针对脊髓损伤大鼠星形胶质细胞的影响及机制

目的 观察电针治疗脊髓损伤大鼠的行为功能及脊髓损伤部位胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和阶段性特异性胚胎抗原-1 (SSEA-I)的表达,阐明电针对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生及分化的影响及其机制.方法 将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针治疗组,每组20只.分别于脊髓损伤造模后第3、7、14、28天时进行BBB评分(Basso-Beaie-Bresnehan scale),并用免疫组化方法检测大鼠脊髓损伤部位GFAP和SSEA-1变化并与对照组比较.结果 电针组与模型组在3d和7d时,GFAP和SSEA-1阳性细胞数有差异(P＜0.01),7d时阳性细胞数达到峰值,在14d时电针组和模型组的阳性细胞数有差异(P＜0.05),而在28 d时,电针组和模型组GFAP阳性细胞无明显差异(P＞0.05),但SSEA 1阳性细胞有统计学差异(P＜0.05).结论 电针治疗能够增加脊髓损伤模型大鼠星形胶质细胞逆分化,激发星形胶质细胞的干细胞潜能,从而促进损伤后脊髓功能的恢复;损伤后的脊髓GFAP和SSEA-1阳性表达的高峰期都在7d,提示脊髓损伤后7d内可能为电针治疗介入的黄金期.     

辛伐他汀在弥漫性轴索损伤后神经保护中的作用及其机制

目的探索辛伐他汀预处理在弥漫性轴索损伤(DAI)后神经保护中的作用,并初步阐明可能的机制。方法采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置制备大鼠DAI模型,模型制作前随机给予白开水或辛伐他汀[60mg/(kg·d)]灌胃1周,DAI后24h用改良神经功能缺损程度评分(mNSS)评估神经功能状态,处死并取脑,脑组织切片行HE染色、Mallory磷钨酸苏木素染色、淀粉样蛋白前体(APP)免疫组化染色及TUNEL染色,另外大鼠用于提取脑组织蛋白行RhoA活性检测。结果 DAI后大鼠都出现明显神经功能缺失,组织病理学可见神经元死亡,轴突断裂。辛伐他汀预处理后神经功能有明显改善,APP分数明显降低,TUNEL染色强度也有降低。RhoA活性检测结果显示DAI后RhoA活性升高,但此效应可被辛伐他汀抑制。相关性分析显示RhoA活性与APP分数及TUNEL结果都有显著相关性。实验前后大鼠的生理指标和血液生化指标无明显差异。结论辛伐他汀可改善DAI后神经功能状态,且此作用与抑制RhoA活性有关。     

大鼠弥漫性轴索损伤后突起坍塌蛋白Sema3A及其受体neuropilin-1的表达

目的研究突起坍塌蛋白(semaphorin 3A,Sema3A)及其受体神经纤毛蛋白1(neuropilin-1,NRP-1)在弥漫性轴索损伤(DAI)大鼠脑组织中的表达,探讨二者在DAI后脑损伤及神经修复中的可能作用及分子机制。方法健康成年雄性SD大鼠48只,随机分为4组:对照组、DAI后6h、24h、7d组,每组各12只。采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置,制作大鼠颅脑DAI模型,改良NSS法评估大鼠神经功能的改变。按预定时间点灌注取脑进行HE及镀银染色,免疫荧光染色检测Sema3A和NRP-1的表达定位。RT-PCR与Western blot分别检测皮质、海马、脑干Sema3A和NRP-1的mRNA及蛋白表达。结果 DAI造模后在脑干、皮髓交界区、胼胝体等部位观察到神经轴突有不同程度的肿胀、迂曲、断裂、轴索球形成等病理征象,并有不同程度的神经细胞变性、核固缩等改变,伤后24h最明显。免疫荧光显示Sema3A主要表达于各脑区神经元,NRP-1表达于神经元、星形胶质细胞及微血管内皮细胞。对照组Sema3A和NRP-1mRNA及蛋白表达水平较低,DAI后6h其表达显著升高,24h达高峰,并持续到7d。结论 Sema3A及其受体NRP-1在DAI大鼠脑组织内表达升高,参与神经损伤及修复的病理生理过程。