热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定

目的检测已构建热反应元件修饰的端粒酶逆转录酶hTERT基因启动子(8HSEs-hTERTp)调控的基因表达载体肿瘤特异性和热诱导特性。方法①RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测细胞内hTERT mRNA和蛋白表达水平,选择hTERT高表达和低表达的细胞株作为该研究阳性细胞株和阴性细胞株;②收集前期已包装成功的热反应元件8HSEs和人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp联合调控自杀基因PNP表达的慢病毒表达载体8HhP病毒液,感染hTERT+SW480细胞及hTERT-MKN28细胞、hTERT-MRC-5细胞,细胞免疫荧光技术检测该治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性;并用Western blot和RT-PCR分别检测热刺激条件下目的基因PNP在不同hTERT水平细胞株中的表达水平。结果 hTERT mRNA及蛋白在SW480细胞中高表达,在MKN28细胞和MRC-5细胞中低表达甚至阴性表达;免疫荧光、RT-PCR和Western blot结果显示,8HSEs-hTERTp调控的目的基因PNP只有在43℃处理下的SW480细胞中呈现高表达,而在阴性细胞株MKN28和MRC-5中PNP表达较少,而常温下SW480细胞中PNP的表达水平明显低于热处理组。结论 8HSEs修饰的hTERT启动子可以明显提高治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对HepG2中抑癌基因MIA2表达的影响

目的应用甲基化酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)作用肝癌细胞株HepG2,观察其对细胞增殖和凋亡的影响,并观察用药后肝癌细胞中黑色素瘤抑制蛋白2(melanoma inhibitory activity 2,MIA2)表达的变化情况。方法分别以浓度0、1、2、4、8、10、20、40μmol/L的5-Aza-CdR作用HepG2细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。再以0μmol/L和10μmol/L的5-Aza-CdR作用HepG2细胞,细胞免疫组化和Western blot检测细胞中MIA2蛋白表达。结果 5-Aza-CdR作用HepG2后,MTT结果显示细胞增殖受到抑制,在一定药物浓度范围内,细胞增殖抑制率和药物浓度呈正相关;流式细胞术结果显示细胞早期凋亡增加,在一定药物浓度范围内,早期凋亡率和药物浓度呈正相关;细胞免疫组化和Western blot结果显示与对照组(0μmol/L)比较,10μmol/L组中MIA2蛋白表达增强。结论 5-Aza-CdR作用HepG2细胞后,MIA2蛋白表达明显增强,细胞增殖受到抑制,早期凋亡增加。     

去甲肾上腺素对胰腺癌细胞株MiaPaCa-2侵袭能力的影响

目的 探讨经典神经递质去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)对人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2侵袭能力的影响及其作用机制.方法 取人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2为研究对象,实验分为空白对照组、0.1μmol/L NE干预组、1μmol/L NE干预组和10μmol/L NE干预组.干预48h后,采用Transwell侵袭实验检测各组中MiaPaCa-2细胞侵袭能力的变化;RT-PCR法检测细胞中MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA的表达;免疫细胞化学法检测细胞中MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白的表达.结果 1μmol/L NE干预组和10μmol/L NE干预组MiaPaCa-2细胞的侵袭能力均高于空白对照组(P<0.01);1μmol/L NE干预组和10μmol/L NE干预组MiaPaCa-2细胞中MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA和蛋白表达水平均高于空白对照组(P<0.05).结论 NE可以通过上调MMP-2、MMP-9和VEGF的表达从而促进胰腺癌细胞发生远处侵袭转移.     

姜黄素对多巴胺诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的探讨姜黄素对多巴胺(dopamine,DA)氧化应激损伤PC12细胞(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株)的拮抗作用的分子机制。方法以DA损伤PC12细胞为氧化应激损伤的模型,依次分成空白对照组、姜黄素组(20μmol/L)、DA组(200μmol/L)及DA(20μmol/L)+姜黄素组(200μmol/L),细胞培养24h后,采用MTT法检测细胞的增殖状况,采用Western blotting检测Bcl-2、Cyt-c及Caspase-3等蛋白的表达水平。结果①姜黄素可使DA对PC12细胞的抑制率明显下降。②姜黄素抑制DA诱导的细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调。姜黄素本身能上调细胞内Bcl-2的蛋白表达水平。③姜黄素抑制DA诱导的细胞凋亡蛋白Cyt-c表达上调。④姜黄素抑制DA上调细胞内裂解型Caspase-3蛋白的表达,但姜黄素本身对裂解型Caspase-3的表达无影响。结论姜黄素对DA氧化应激损伤PC12细胞的拮抗作用是通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调及抑制Cyt-c及Caspase-3的上调来实现的。     

双靶向诱导超抗原TSST-1基因重组逆转录病毒的包装及鉴定

目的包装出携5拷贝缺氧反应元件(5 HRE)增强子和癌胚抗原启动子(CEAp)联合调控的超抗原中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)基因的逆转录病毒,并建立稳定表达TSST-1的人结肠癌Lovo细胞株。方法应用已构建好的逆转录病毒载体pLEGFP-N1-5 HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM,与辅助质粒pMB-MLV、pMB-G共转染入293T细胞,LaSRT法检测病毒滴度。包装出的逆转录病毒感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo和CEA阴性的人宫颈癌细胞株Hela。应用RT-PCR和免疫组化方法鉴定TSST-1的表达。结果获得重组逆转录病毒滴度约为1×106CFU/mL。RT-PCR及免疫组化证实经病毒感染的Lovo细胞在mRNA和蛋白水平均有TSST-1表达,缺氧环境中的mRNA表达量更高,且细胞传代20次后依然有TSST-1 mRNA表达;经病毒感染的Hela细胞在常氧或缺氧状态下均无TSST-1 mRNA及蛋白表达。结论包装出较高滴度重组逆转录病毒,并能靶向性在CEA阳性肿瘤内稳定表达TSST-1,为后续检验TSST-1对肿瘤的杀伤效应奠定了基础。     

缺氧调控表达的NT-3逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建与鉴定含有5个拷贝缺氧反应元件(five copies of hypoxia responsive elements,5HRE)的缺氧调控表达的神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的逆转录病毒载体。方法用PCR、酶切和连接等分子克隆技术将5HRE和人来源NT-3片段克隆入逆转录病毒载体pLNCX中,构建重组逆转录病毒穿梭质粒pLNCX-5HRE-SV40-NT3-IRES-EGFP。经PT67包装细胞包装、高速离心纯化和浓缩等方法,获得逆转录病毒RV-5HRE-NT3;用逆转录病毒感染NIH 3T3细胞48h后,流式细胞仪检测并计算出病毒滴度。结果成功构建了重组逆转录病毒载体质粒pLNCX-5HRE-SV40-NT3-IRES-EGFP,并获得相应的逆转录病毒RV-5HRE-NT3,经过高速离心纯化和浓缩后,其滴度可达9.1×10~6 cfu/mL。结论成功构建了缺氧调控表达的NT-3逆转录病毒载体,为研究外源基因的缺氧调控特异性表达奠定了工作基础。     

TTF-1启动子调控miR-7表达对人肺癌95D细胞体外凋亡的影响

目的观察甲状腺转录因子-1(TTF-1)启动子调控miR-7表达对人肺癌细胞体外凋亡的影响,并探讨其意义。方法将前期构建的TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体(命名为p-T-miR-7)与对照载体p-cont分别体外瞬时转染人肺癌95D细胞,采用FCM法检测95D细胞凋亡比例;TUNEL法检测95D细胞凋亡情况;Western blot检测各组中磷酸化Caspase3和磷酸化Caspase9的蛋白的表达;共聚焦显微技术检测miR-7靶分子CGGBP1和EGFR蛋白的表达;最后,采用Western blot检测各组中磷酸化Akt和Erk蛋白的表达。结果体外转染48h后,与p-cont转染组相比,转染p-T-miR-7组细胞凋亡比例明显增加(P<0.05);磷酸化Caspase3和磷酸化Caspase9蛋白水平均显著增加(P<0.05),同时EGFR和CGGBP1蛋白表达均明显降低,且细胞中磷酸化Akt和Erk蛋白水平亦显著降低(P<0.05)。结论 TTF-1启动子调控miR-7表达可导致人肺癌细胞的凋亡。这为后续基于miR-7的人肺癌基因靶向治疗策略的开发提供了前期实验依据。     

芹菜素通过抑制NF-κB信号通路缓解高糖对雪旺细胞的损伤

目的研究芹菜素对高糖培养条件下雪旺细胞损伤的保护作用,为芹菜素治疗糖尿病周围神经损伤提供初步的实验依据。方法体外培养RSC96雪旺细胞,分为对照组(葡萄糖浓度为5.6 mmol/L)、高糖组(培养液葡萄糖浓度为50 mmol/L)和芹菜素组(在高糖基础上加入0.1、1.0、10.0μmol/L芹菜素)。CCK-8法检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测神经生长因子(NGF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达;Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB的表达。qRT-PCR检测细胞中Bcl-2和Bax的mRNA表达。结果与高糖组比较,低浓度的芹菜素(≤1.0μmol/L)提高细胞活性(P<0.05),并存在浓度依赖性;10.0μmol/L芹菜素对细胞增殖则没有明显作用。1.0μmol/L芹菜素显著抑制高糖培养条件下细胞凋亡(P<0.05)。同时,芹菜素显著增加高糖培养条件下细胞中Bcl-2蛋白和mRNA表达,但抑制Bax基因蛋白和mRNA表达。与高糖组比较,1.0μmol/L芹菜素显著增加NGF表达,并抑制TNF-α表达(P<0.05)。此外,芹菜素可显著抑制高糖培养条件下NF-κB磷酸化水平(P<0.05)。结论芹菜素增加高糖诱导的雪旺细胞活性,抑制细胞凋亡并调节NGF和TNF-α表达,该机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

PI3K抑制剂对四氯化碳刺激的肝星状细胞增殖和Ⅰ型胶原表达的影响

目的 探讨PI3K抑制剂对四氯化碳(CCl4)刺激的肝星状细胞(HSC)增殖和Ⅰ型胶原表达的影响,为肝纤维化的治疗提供理论基础.方法 将液氮保存下的HSC株,于37℃,50 mL/L CO2孵育箱中复苏传代培养,同步化后将细胞分为5组:空白对照组、CCl4组、CCl4+1 μmol/L PI103组、CCl4+2μmol/L PI103组、CCl4 +4 μmol/L PI103组,分别培养48 h.用透射电子显微镜初步观察了细胞形态改变;MTT比色法测定细胞增殖情况;免疫细胞化学测定细胞的Ⅰ型胶原表达情况.结果 CC14组与空白对照组比较,细胞生长旺盛,细胞数目增多,Ⅰ型胶原表达增多;透射电子显微镜下可见CCl4+4μmol/L PI103组比CCl4组凋亡细胞显著增多,细胞数目减少;MTT和免疫细胞化学实验结果显示,与CCl4组比较,CCl4+1μmol/L PI103组、CCl4 +2μmol/L PI103组、CCl4 +4μmol/L PI103组细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达均减少,随着PI103剂量加大,细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达均减少,但CCl4+4 μmol/L PI103组和CCl4+2μmol/L PI103组比较,细胞的增殖无明显变化.结论 PI3K抑制剂PI103可抑制活化的HSC的增殖,促进其凋亡以及减少其Ⅰ型胶原的表达.