HEK293细胞中杂合状态下无义突变体L539fs/47对野生型HERG电流的作用

目的研究单独表达无功能的无义突变体L539fs/47在HEK293细胞中杂合状态下对野生型HERG电流的作用。方法用脂质体转染法将野生型HERG及突变体HERG-L539fs/47分别转染HEK293细胞36h后,RT-PCR检测HERG mRNA表达,免疫荧光及免疫印迹检测HERG蛋白定位及表达量,全细胞膜片钳检测IHERG电流密度。结果野生组HERG的mRNA表达量高于L539fs/47突变组(1.066±0.612 vs.0.254±0.397,P<0.01)。免疫荧光检测发现野生型HERG蛋白多于突变体,野生型HERG蛋白主要分布在细胞膜上;而HERG突变体蛋白大部分滞留胞质。免疫印迹显示:不同于野生型HERG135ku及155ku 2个条带,突变体仅60ku 1个条带。全细胞膜片钳检测WT+MT组IHERG较WT组下降55.23%(22.03±2.62 vs.49.20±2.31pApF,P<0.01)。结论 HEK293细胞中杂合状态下截断突变体L539fs/47对野生型HERG电流的不完全负显性抑制作用。     

钠通道SCN5a突变体R104W的构建及验证

目的构建并验证Brugada综合征相关钠通道SCN5a基因R104W突变体。方法采用一步法PCR突变技术,以pEGFP-SCN5a为模板,体外定点诱变构建pEGFP-SCN5a-R104W突变体,进行基因测序,并用Lipofectamine TM3000脂质体转染法转入HEK293细胞,通过Western blotting和膜片钳记录检测蛋白质表达和电流加以验证。结果测序结果显示SCN5a-R104W突变体基因序列上第310C>T,其他序列碱基与野生型相比未发生改变;Western blotting结果显示SCN5a-R104W突变体蛋白表达量较野生型SCN5a降低;荧光显微镜下显示SCN5a-R104W突变体蛋白位于胞质内;SCN5a-R104W突变体转染后膜片钳记录未能检测到钠电流,且R104W突变体对野生型通道有负显性抑制作用。结论成功构建并验证SCN5a基因R104W突变体。     

人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有人神经菌毛素-1(NRP-1)基因和3Flag标签蛋白基因的腺病毒载体,为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供实验基础。方法应用AgeⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切含有人NRP-1基因的质粒,再将其与酶切线性化的pDC315-3Flag载体片段连接,构建穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag;应用腺病毒骨架质粒pBHGlox△E13Cre与此穿梭质粒共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒,进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定;用PCR和基因测序方法验证穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag的构建;再通过荧光显微镜和Western blot方法,分别检测质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒转染HEK293细胞后NRP-1蛋白的表达情况。结果经PCR和测序分析,证实穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag与设计一致;穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒分别转染HEK293细胞后,经Western Blot均检测出在95¹30ku处有条特征带,其大小和NRP-1-3Flag融合蛋白(104ku)相吻合;滴度测定为2.00E+11PFU/mL。结论成功构建了人NRP-1基因重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞中表达。     

乙型肝炎病毒全X基因对HEK293细胞功能的影响

目的克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异。方法应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;Annexin V流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化。结果成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)%和(0.805±0.013)%,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)%和未转染对照组(0.681±0.018)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)%及(21.34±2.16)%,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)%及未转染细胞对照组(11.37±1.58)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用。     

miR-497靶向调控疾病易感基因EFNB2的分子机制研究

目的用分子克隆和双荧光素酶报告基因的方法研究miR-497对精神分裂症易感基因EFNB2的靶向调控作用,为miR-497在精神分裂症中的分子功能研究奠定基础。方法运用生物信息学在线软件预测,发现与精神分裂症相关的miR-497可能直接调控疾病易感基因EFNB2。随后采用分子生物学技术扩增EFNB2基因3′-UTR中包含与miR-497种子序列相结合的片段,将该片段连接入pmirGLO质粒载体构建野生型的重组体(WT),并突变EFNB2基因3′-UTR与种子序列相结合的碱基序列,构建突变型的重组体(MUT)。最后将miR-497阴性对照(NC)和模拟物(mimics)分组转染HEK293T细胞系,并在24、48h后分别进行双荧光素酶报告基因活性测定。结果测序结果表明EFNB2基因3′-UTR的野生型(WT)和突变型(MUT)分别成功构建入pmirGLO载体中,表明WT和MUT的重组体均构建成功。转染24、48h后的双荧光素酶报告基因活性检测结果表明,miR-497mimics与NC相比,显著性降低了报告基因的活性。结论本研究在细胞水平证明了miR-497可直接调控精神分裂症易感基因EFNB2,为后续miR-497在精神分裂症中的功能研究提供了新思路和新线索。     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7蛋白在NIH/3T3细胞中的表达和定位

目的　将带有人乳头瘤病毒 1 6型 (湖北株 )E7基因的真核表达载体 pL(E7 HB)SN导入NIH/3T3细胞进行瞬时表达。方法　重组质粒转染 3T3细胞通过DNA 磷酸钙共沉淀法 ;E7基因表达的检测采用RT PCR和间接免疫荧光实验。结果　E7基因导入真核细胞后能有效转录并表达E7蛋白 ,通过免疫荧光染色可看到E7蛋白主要定位在胞浆中 ,细胞核中也有 ,但量较少。结论　这可能和湖北株HPV1 6E7基因发生突变有关。     

心脏传导阻滞SCN5A基因L1001Q突变体构建和功能研究

目的对作者发现的一个中国3代人心脏传导阻滞家系SCN5A基因新突变L1001Q,构建突变表达载体,利用分子生物学方法和全细胞膜片钳技术观察L1001Q突变的功能。方法一步定点诱变法构建pEGFP-L1001Q-SCN5A突变体;激光共聚焦和Western blotting技术检测突变蛋白定位和表达;全细胞膜片钳技术观察突变体钠电流。结果野生型和L1001Q突变均表达在细胞膜上,且表达量无明显变化。二者最大激活电流分别为(148.34±0.77)pA/pF和(132.59±0.96)pA/pF(P>0.05),L1001Q突变半失活电压V1/2为(-73.25±0.87)mV,较野生型正向转移约3.5mV[V1/2为(-76.71±0.73)mV,P<0.05],L1001Q突变失活后恢复时间常数较野生型稍减小,差异无统计学意义(WT tau=16.8ms,L1001Qtau=14.1ms,P>0.05)。结论 L1001Q突变未影响钠通道蛋白的表达和转运,主要通过改变钠通道门控特性引起钠通道功能减弱进而导致心脏传导阻滞。     

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以EcoRⅠ和BamHⅠ将腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%～94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10~(13)vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的hTSHR289蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。     

hGPx-1-198Leu真核表达载体的构建与鉴定及在H9C2细胞中的表达

目的构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据。方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,通过限制性内切酶酶切目的片段和真核表达载体pEGFPN3,再用T4DNA连接酶将含有目的基因的片段定向插入到载体pEGFP-N3真核人巨细胞病毒启动子下游。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆、提取质粒进行鉴定。将hGPx-1-198Leu真核表达载体转染HEK293细胞,观察转染效率,并采用RT-PCR检测转染重组载体后细胞中GPx-1的mRNA表达水平。重组载体转染H9C2细胞,观察补硒之后的GPx-1表达情况。结果获得目的基因cDNA片段全长869bp,PCR和测序鉴定载体中含有人GPx-1-198Leu基因cDNA。重组载体转染HEK293细胞后检测到GPx-1的mRNA水平比未转染组及空质粒转染组明显升高,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制奠定了基础。H9C2细胞在转染后GPx-1蛋白水平升高并且随着硒浓度的升高而升高。结论成功构建了含Pro198Leu多态位点的hGPx-1真核表达载体,并且也插入了保证该基因有效表达的硒代半胱氨酸插入序列。     

K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌靶基因表达的抑制作用

目的　观察针对于胰腺癌K ras基因点突变的反义寡核苷酸对靶基因表达的抑制作用。方法　脂质体将人工合成的针对于K ras基因第 12位密码子点突变的反义寡核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC 2 ,用免疫组化和原位杂交技术检测靶基因的表达。结果　转染 4 8h后 ,反义寡核苷酸作用组胰腺癌细胞株PC 2的ras蛋白和K rasmRNA的表达程度较正义组和对照组均明显降低 (P <0 .0 5 )。结论　针对于K ras基因点突变的反义寡核苷酸作用于体外培养的胰腺癌细胞 ,对靶基因的表达有明显的抑制作用     

隧道出渣设备最佳配合分析

针对隧道出渣时,装载机与倾卸车联合作业中的配合问题进行了深入的研究,分析并建立两种施工机械最佳配合关系的数学模型,通过实例计算表明,此模型及算法对施工单位在隧道施工中合理地确定两者数量关系具有一定的指导意义.     

中国经济增长的波动分析

对国民经济增长的波动进行计算分析。应用Mexican Hat小波对国内生产总值（GDP）的增长率进行多时间尺度分析，再利用宏观经济学的理论从政府宏观调控政策、投资、消费等方面分析引起波动的原因。在不同时间尺度下，经济波动受到政策、投资和消费及重大政治事件的影响。通过对经济增长波动的因素及规律的分析，可以提高对经济发展的预见性，促进经济更好的增长。     

速腾轿车蓄电池亏电故障检修

一辆搭载BPL型发动机的一汽大众速腾1．8L轿车,该车在停放时偶尔会发出“嗡嗡的异响”,并出现发动机无法启动的故障现象。经检查,发现车辆熄火后冷却风扇偶尔会自行运转。结合其电源管理系统,通过分析冷却风扇的工作原理及电路图,发现故障是由于主继电器的不正常吸合引起的,更换主继电器,故障排除。     

Assessment of Quality of Service of Virtual Knowledge Communities

An assessment method for the quality of service (QoS) of virtual knowledge communities (VKC) is proposed based on fuzzy theory and analytic hierarchy process (AHP). The QoS is evaluated in terms of Website design, reliability, responsiveness, trust,personalization, and information quality. The cognitive QoS and the QoS evaluated by assessors are compared to analyze which QoS of the VKC should be improved urgently and which indicators keep leading positions, and to assist administrators of the VKC on measuring and understanding current status and implementation effect of the QoS.     

聚丙烯纤维混凝土配合比均匀性研究

聚丙烯纤维混凝土以其独有的特点,越来越得到广泛的应用.介绍了利用均匀设计法对聚丙烯纤维混凝土的配合比进行优化分析的过程,选取水泥、速凝剂掺量、聚丙烯纤维掺量三个影响因素,对混凝土配比试件的试验数据统计结果进行回归分析,结果表明,在设定试验条件下,在每立方米混凝土中掺入0.9kg聚丙烯纤维的方案是比较合理的.     

桥梁板式橡胶支座抗压弹性模量分析

简要介绍桥梁板式橡胶支座抗压弹性模量的计算及试验方法,同时从几个方面分析影响该指标的因素.     

弓网离线模拟试验平台的设计

受流问题是制约电气化铁路提速的瓶颈之一,而弓网离线电弧是高速列车受流的关键问题.为了全面的把握弓网离线状态,设计了弓网离线模拟试验平台.实现正弦周期内不同时刻离线及回合过程的电弧放电现象,并采用示波器和数据采集卡实现对离合瞬间电压、电流和光强等波形的同步记录,为弓网离线检测法和列车受流质量的研究及抑制电弧危害打下基础.     

钢筋混凝土简支梁桥梁体病害分析及维修方法

随着经济的发展、综合国力增强,交通事业日新越益发展,桥梁建设取得了长足的进步,为我国的各项事业的发展提供了坚强的基础,但随之而来的桥梁病害问题也日益严重,针对上述情况,本文将对钢筋混凝土简支梁桥梁体的常见病害进行归纳和总结,并提出一定的维修措施,以便能够减轻同类病害的发生,为今后的公路事业发展提供参考依据.     

高速公路采空区治理的监理

针对衡枣高速公路途径的采空区治理问题，介绍了采空区从勘探、治理到质量检验全过程的监理工作。描述了采空区的治理情况和监理工作思路、方法，指出了采空区治理监理工作中应把握的工作要点。     

纳米Ni粉对Cu粉末烧结性能的影响

研究了纳米Ni粉对Cu粉末烧结性能的影响。研究表明：由于添加1％纳米Ni粉中的NiO未被完全还原,而且纳米Ni粉本身还有被CuO氧化成NiO的可能,因而纳米Ni粉在Cu粉末烧结过程中未能起到活化烧结的作用。相反,添加1％纳米Ni粉后还降低了Cu粉末烧结性能。