W基因组织表达的特异性

Ｗ基因是利用周转神经髓鞘蛋白ＰＭＰ－２２基因的编码区５’－及３’－序列引物，藉ＰＣＲ方法自人脑胶质瘤ｃＤＮＡ文库中扩增的一个基因片段，本实验研究Ｗ基因组织表达的特性性。方法搜集不同组织来源的肿瘤及正常脑组织标本，行ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＮＡ斑点杂交检测。     

分泌抗RSV单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本实验用呼吸道合胞病毒(RSV)Long 株免疫的 BALB/c 小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/o 融合,经次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)选择培养,获得5株抗体阳性杂交瘤细胞株.将2F4株3次克隆化,阳性率100%。连续传代3个月和液氮冻存3个月后仍能稳定分泌 RSV 单克隆抗体(McAb)。该抗体属 IgGl亚类.只与 RSV 抗原反应;能中和 RSV 的感染性;可被 RSV Long 株感染的 Hep-2细胞吸收.ELISA 测定,2F4株上清和腹水效价分别为10~(-2)和10~(-7)。4℃保存3个月其抗体活性无明显变化.     

抗鸭乙肝病毒core蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗鸭乙肝病毒core蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。方法 PCR扩增鸭乙肝病毒(DHBV)core基因片段,构建表达载体pET28a(+)/DHBV core。转化诱导表达融合蛋白,用Ni 2+亲和柱纯化目的蛋白。免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选,采用有限稀释法筛选单克隆杂交瘤细胞并进行细胞克隆。体内诱生法大量制备单克隆抗体,进行抗体的特异性、效价和亚型的鉴定。结果成功构建表达载体pET28a(+)/DHBV core,并表达DHBV core蛋白。获得2株稳定分泌抗DHBV core抗体的杂交瘤细胞株,分别为2D7和5G10,细胞培养液抗体效价为1∶400和1∶800。选择5G10细胞株制备单克隆抗体,小鼠腹水抗体效价可达1∶320 000。鸭肝组织免疫组化结果显示,DHBV病毒载量>1010copies/mg的肝组织中DHBV core蛋白的表达明显高于病毒载量<105copies/mg的肝组织,而未感染DHBV的鸭肝细胞内不表达DHBV core蛋白。亚型鉴定结果为IgG2aκ链。结论制备并获得了抗DHBV core蛋白的单克隆抗体,为DHBV core蛋白的功能研究、诊断试剂的研制与抗病毒治疗研究奠定了基础。     

β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备

目的　制备稳定分泌β -淀粉样肽 1～ 4 2 (Aβ1-42 )单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,产生高效价抗体。方法　通过基因工程技术 ,将Aβ1-42 基因融合于乙肝核心抗原 (HBcAg)的主要免疫优势区 (MIR) ,制备Aβ和HBcAg的融合蛋白 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0细胞融合 ,筛选能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果　得到两株能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,Aβ1-42 单克隆抗体的Ig亚类为IgG3 。结论　制备得到的Aβ1-42 单克隆抗体特异性强 ,效价高     

结核杆菌DnaA蛋白的原核表达及免疫血清的制备和检测

目的 在大肠杆菌中表达重组结核杆菌DnaA蛋白,对表达产物进行纯化、鉴定后制备DnaA蛋白特异性免疫血清并进行Western blot检测.方法 以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组为模板,PCR扩增DnaA基因,构建DnaA原核表达质粒pET-DnaA,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表...     

蛋白酶活化受体-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备蛋白酶活化受体-1(PAR-1)单克隆抗体(mAb)。方法以PAR-1特异性片段为免疫原(13肽)免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗PAR-1 mAb。采用捕获酶联免疫吸附试验(capture ELISA)鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、Dot blot、免疫组化染色法、流式细胞仪分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性。结果获得2株可稳定分泌抗PAR-1 mAb的杂交瘤细胞,其亚型分别为IgMI、gG2b。免疫组化染色表明,mAb与人扁桃体、结肠组织中的淋巴细胞、包皮组织中的成纤维细胞、肺组织中的巨噬细胞反应呈阳性。流式细胞仪分析显示,2株mAb与人肺腺癌细胞系A549细胞胞浆内及细胞膜上的PAR-1均呈阳性反应。激光共聚焦扫描显微镜观察,荧光标记的阳性反应物在A549细胞胞浆内及细胞膜上均可见。结论成功地制备出抗PAR-1 mAb,为进一步研究炎症性疾病提供有用的试剂。     

胆囊癌组织及胆汁中厌氧菌谱的检测

为探讨厌氧菌感染与胆囊组织癌变的相关关系 ,采用微生物自动检测鉴定系统 ,对 2 9例胆囊癌患者的胆囊胆汁及 9例胆囊癌中心组织进行厌氧菌培养及自动检测分析。结果 2 9例胆囊癌胆汁中厌氧菌检出率为 6 5 .5 % ( 1 9/2 9) ,胆囊癌组织检出率为 5 5 .6 % ( 5 /9) ,且均为兼性厌氧。两者厌氧菌株均以产气荚膜梭菌为主。认为胆囊粘膜癌变可能与厌氧菌尤其是产气荚膜梭菌感染有关 ,厌氧菌与需氧菌协同作用 ,长期刺激胆囊粘膜是导致其癌变的主要因素。而利用微生物生长曲线中对数生长期进行培养是提高厌氧菌阳性率的关键。     

抗人钠碘转运体单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与鉴定

目的　利用合成短肽制备抗人钠碘转运体 (NIS)单克隆抗体。方法　以人NIS蛋白质的两个片段 (第 2膜外段和第14f段 )为抗原免疫小鼠 ,运用杂交瘤技术 ,制备鼠抗人NIS单克隆抗体 (rhNISMAb) ,然后采用小鼠Ig亚类测定试剂条测定单抗的亚类 ,并通过ELISA、Western blot、免疫组化染色等技术鉴定其特异性。结果　运用杂交瘤技术成功地制备出能稳定分泌抗人NIS单克隆抗体的细胞系。Western blot分析表明 :此单抗所识别的靶分子的相对分子量主要在 97KD ,免疫组化染色显示 :甲状腺滤泡细胞膜上有棕黄色着色 ,以基底侧最为明显。结论　成功地制备出抗人NIS单克隆抗体 ,为NIS抗原 抗体的研究提供了新的工具     

大鼠激活转录因子3单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备特异性识别大鼠激活转录因子3(ATF3)的单克隆抗体(mAb)。方法根据软件预测的结果合成偶联有匙孔绒血蓝蛋白(key holeli mpet hemocyanin,KLH)的大鼠ATF3第168-181位氨基酸多肽。随后免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗大鼠ATF3的mAb。采用快速定性试纸法鉴定该单克隆抗体的亚型和亚类;通过ELISA、Western blot和免疫组织化学法鉴定单克隆抗体的特性。结果获得一株可稳定分泌抗大鼠ATF3 mAb的杂交瘤细胞,其分泌的ATF3单抗的亚型是IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,该单抗能够特异性识别大鼠细胞内表达的ATF3蛋白。免疫组织化学检测结果表明,在Thy-1肾炎(Thy-1N)大鼠肾细胞胞质及细胞核内均有ATF3表达,但细胞核内的表达量较为显著。结论成功制备了一株抗大鼠ATF3的mAb,为进一步研究ATF3的生物学功能提供了可用的实验材料。     

单克隆抗体DH7识别抗原与胃癌增生及分化的关系

应用免疫组化ＡＢＣ法观察ＤＨ７识别抗原在５３例胃粘膜不典型增生和胃癌组织中的表达，结果显示胃粘膜不典型增生和高分化腺癌的阳性率分别为７／７，９／９，低分化腺癌阳性率为１４／１６，其中高分化腺癌与低分化腺癌的强阳性率分别为７／９和１／１６，两者间具有高度显著性差异。     

Polyclonal antibody preparation and expression in liver tissues of transactivated protein 5 of hepatitis C virus nonstructural 5A

Objective To prepare polyclonal antibody of transactivated protein 5 of hepatitis C virus nonstructural 5A (NA5ATP5) and to explore its expression in the liver tissues. Methods In Escherichia coil BL21, the prokaryotic expression vector pET32a(+)-NS5ATP5 was induced by isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), and it was analyzed with sodium dodecyl sulfate-polyaerylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting. And the purified protein was used to immunize the rabbit to prepare polyelonai antibody, with which we studied the function of NSSATP5 by determining the different liver tissues with the streptavidin-perosidase (SP) immunohistochemistry method. Results Recombinant NS5ATP5 (molecular weight: 65 kD) and polyclonal antibody were successfully prepared. NS5ATP5 expression in the liver of patients with chronic HCV infection was much higher than that of a normal person, and it was detected mainly in the cytoplasm. Conclusion The findings of the expression difference between HCV patients and normal people led to a novel diagnostic marker to detect HCV infection.     

抗HER-2嵌合抗体chA21对卵巢癌细胞MMP-2和TIMP-2表达的影响

目的观察抗HER-2嵌合抗体chA21对卵巢癌细胞MMP-2和TIMP-2表达的影响。方珐采用免疫细胞化学法检测不同质量浓度chA21（6mg／L和12mg／L组）作用36h后，培养的高表达HER-2人卵巢癌细胞株SKOV3中MMP-2和TIMP-2表达的变化；建立SKOV3裸小鼠移植瘤模型，制作组织芯片，观察chA21（30mg／kg）对肿瘤组织MMP-2和TIMP-2表达的作用。站杲细胞实验显示，随着chA21浓度的升高，MMP-2明显降低（P〈0．01，r=-0．945），而TIMP-2显著升高（P〈0．01，r=0．926），MMP-2／TIMP-2比值也明显降低（P〈O．01，r=-0．945），且均呈浓度依赖性改变；裸鼠荷瘤实验结果显示，chA21能明显下调MMP-2的表达（P〈0．01），上调TIMP-2的表达（P〈0．01），并使MMP-2／TIMP-2明显降低（P〈O．01）。结论chA21能调节高表达HER-2人卵巢癌细胞SKOV3的MMP-2和TIMP-2表达水平。     

The cloning and expression of renalase and the preparation of its monoclonal antibody

To obtain the recombination protein of renalase and prepare the monoclonal antibody, the human renalase gene was amplified from human kidney by specific primer and cloned the DNA fragments into the pET22b. After verification of the positive clones, the gene was transformed to E. coli BL21 to express the protein with 6His on C terminal. The Balb/c mouse was immunized with the purified protein to prepare the monoclonal antibody by hybidoma technique. The renalase protein was reconstructed and 2 strains of the hybidoma which can stable secrete renalase were obtained. The monoclonal antibody can both react with the both recombinant and human serum renalase. Foundation item: the Scientific Research Project of Shanghai Municipal Health Bureau (2008Y034), and the Natural Scientific Research Project of Shanghai (05ZR14086)     

CD_3 McAb联合rhIL-2激活的骨髓对白血病细胞杀伤净化作用的研究

目的　探讨CD3单克隆抗体 (CD3McAb)联合重组人白细胞介素 2 (rhIL 2 )激活的骨髓对白血病细胞的杀伤及净化作用。方法　用MTT法检测激活骨髓的细胞毒作用 ;半固体集落培养法观察激活骨髓CFU GM水平和对白血病细胞的净化作用 ;采用间接荧光法测定激活骨髓的免疫标记。结果　CD3McAb与rhIL 2联合激活的骨髓对白血病细胞株K5 6 2、HL 6 0均有明显的杀伤净化作用 ,且优于rhIL 2或CD3McAb单用组 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。rhIL 2和 (或 )CD3McAb对激活骨髓的CFU GM水平无明显影响。CD3McAb +rhIL 2激活的骨髓 ,与活化前及rhIL 2或CD3McAb组相比 ,CD3+ 、CD8+ 、CD1 9+ 、CD2 5+ 、CD38+ 、CD56+ 细胞显著升高。结论　CD3McAb能增强rhIL 2激活的骨髓对白血病细胞的杀伤及净化作用     

葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在筛选致敏蛋白组分的应用

目的制备、鉴定兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体,并初步应用于葎草花粉致敏蛋白组分的筛选。方法用葎草花粉变应原浸液免疫兔,获得高效价抗葎草花粉蛋白抗血清,应用琼脂免疫双扩散、ELISA法以及Western blotting鉴定产生的抗体。同时对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行Western blotting检测。结果兔抗血清效价经ELISA检测,效价>1∶10000,免疫双扩散结果表明抗血清只与葎草花粉变应原形成特异性IgG沉淀线,Western blotting检测兔抗血清IgG可以特异性识别葎草花粉8种蛋白组分,分子质量分别为100、88、76、69、65、55、49、38 ku,患者血清IgG可以识别5种蛋白组分,分子质量分别为100、76、55、493、8 ku。结论制备的兔抗血清具有较高效价和较好的特异性,应用该血清筛选出的葎草花粉致敏蛋白组分与患者血清筛选的组分相似,因此可进一步应用于初筛cDNA表达文库。     

C57/BL6小鼠海马发育和老化过程中Bcl-2及Bax的表达

目的 观察C57/BL6小鼠海马发育老化过程中Bcl-2、Bax蛋白的表达变化.方法 取不同胚龄(embryonic day,E)、生后(postnatal day,P)日龄或月龄的小鼠海马,应用免疫组化及图像分析技术检测Bcl 2和Bax蛋白的表达.结果 E16 d～P7 d,海马CA区锥体细胞层和齿状回颗粒细胞层B...     

小鼠抗人T淋巴细胞表面抗原噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建并筛选小鼠抗人静息 /活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库。方法　以人静息 /活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞 ,RT -PCR扩增VH 和VK 基因 ,拼接为ScFv ,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌 ,构建了噬菌体展示抗体库 ,以人T淋巴细胞为靶抗原 ,对该库进行了 3轮淘洗 ,ELISA方法鉴定噬菌体抗体。结果　成功构建了最大实际库容量为 1 .75× 1 0 6的小鼠抗人静息T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库和小鼠抗人活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库。结论　所构建的抗体库可进一步用于对T淋巴细胞表面蛋白抗原的差异显示分析及构建基因工程抗体。     

COX-2、VEGF在腹腔粘连组织中的表达及其意义

目的 探讨COX-2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在人体腹腔粘连组织中的表达及其与腹腔粘连发生发展生物学行为的关系.方法 收集40例二次手术患者的粘连组织和20例初次手术患者的正常腹膜组织标本,采用免疫组化方法检测粘连组织COX-2、VEGF及微血管密度(microvessel density,MVD)的表达情况并作相关分析.结果 COX-2、VEGF、MVD在粘连组织中的阳性表达显著高于正常腹膜组织(P<0.05);COX-2表达与腹腔粘连程度相关(P<0.05);VEGF表达与腹腔粘连程度及二次手术时间间隔相关(P<0.05);COX-2、VEGF、MVD呈两两正相关.结论 COX-2、VEGF参与人体术后腹腔粘连的发生、发展,可能与COX-2介导的上调VEGF表达等途径促进粘连组织血管生成有关,可作为粘连形成机制中血管发生的重要生物学指标.