多发性骨髓瘤小鼠注射重组鼠源促红细胞生成素后对免疫功能的影响

目的探讨重组人红细胞生成素(rhEPO)对多发性骨髓瘤小鼠免疫功能的影响。方法建立多发性骨髓瘤小鼠模型,随机分为4组,即对照组和高、中、低剂量治疗组,治疗组分别给予尾静脉注射重组人源促红细胞生成素2.5、5、10mg/kg,容量为100μL,连续给药30d,对照组给予尾静脉注射等体积生理盐水。实验结束后,采用MTT法测定各组小鼠T、B淋巴细胞增殖能力,中性红实验测定巨噬细胞吞噬能力和ELISA试剂盒测定小鼠血清中TNF-α含量。结果与对照组相比,不同剂量rhEPO治疗组小鼠B、T淋巴细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬能力和血清中TNF-α含量均显著提高(P<0.05)。结论重组人红细胞生成素可显著改善多发性骨髓瘤小鼠免疫调节能力。     

WT1多肽疫苗对荷人单核细胞白血病SCID小鼠的抗肿瘤免疫效应

目的研究WT1多肽疫苗对荷人单核细胞白血病重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠的抗肿瘤免疫效应。方法对SCID小鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞(PBL)后24h,皮下接种THP1细胞,建立SCID小鼠荷人单核细胞白血病模型,随机分组,每组8只。空白对照组的疫苗成分为不完全弗氏佐剂,辅助T细胞表位组的疫苗成分为辅助T细胞表位和不完全弗氏佐剂,WT1多肽组的疫苗成分为WT1多肽、辅助T细胞表位和不完全弗氏佐剂。当肿瘤体积约为100mm3时,开始腹腔注射疫苗成分,疫苗接种14d后处死SCID小鼠。采用乳酸脱氢酶法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤活性,肿瘤组织HE染色后镜下观察组织学特点,利用流式细胞仪检测外周血CD3~+/CD4~+T细胞、CD3~+/CD8~+T细胞及CD4~+CD25~+T细胞水平,应用ELISA方法检测血清中免疫球蛋白、IL-2、IFN-γ、TGF-β及IL-10水平。结果实验成功建立荷人单核细胞白血病SCID小鼠模型,各组中所有动物均成瘤;WT1组小鼠脾细胞对THP1细胞的CTL活性高于辅助T细胞表位组和空白对照组(P<0.05);WT1组小鼠的肿瘤平均体质量及体积均明显低于辅助T细胞表位组和空白对照组(P<0.05);WT1组肿瘤组织HE染色显示肿瘤细胞变性坏死,存活的肿瘤细胞减少;WT1组小鼠外周血CD3~+/CD4~+T细胞、CD3~+/CD8~+T细胞、IgG、IFN-γ和IL-2水平均明显高于辅助T细胞表位组和空白对照组(P<0.05);外周血CD4~+/CD25~+Treg细胞、TGF-β和IL-10水平均明显低于辅助T细胞表位组和空白对照组(P<0.05)。结论 WT1多肽疫苗可在荷人单核细胞白血病SCID小鼠体内产生抗肿瘤免疫效应,有效杀伤白血病细胞。     

全反式维甲酸在多发性骨髓瘤治疗中的作用

目的　探讨全反式维甲酸治疗多发性骨髓瘤的作用机理及其临床效果。方法　采用MTT法、双抗体夹心ELISA法检测了 17例多发性骨髓瘤患者应用全反式维甲酸治疗前后骨髓上清中IL 6活性及可溶性IL 6受体(sIL 6R)水平。结果　与对照组相比 ,多发性骨髓瘤患者骨髓上清中IL 6活性及sIL 6R水平明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,应用全反式维甲酸 5 0d后多发性骨髓瘤患者骨髓上清中IL 6活性及sIL 6R水平明显降低 (P <0 .0 1) ,Ⅲ期多发性骨髓瘤患者的IL 6活性显著高于Ⅰ、Ⅱ期 (P <0 .0 5 ) ,但sIL 6R水平二者无显著性差异 (P >0 .0 5 )。用全反式维甲酸治疗的 17例患者 ,5例完全缓解 (CR)、8例部分缓解 (PR)、4例未缓解 (NR)。结论　全反式维甲酸可能是通过降低IL 6活性及sIL 6R水平而抑制肿瘤细胞生长 ,提高缓解率 ,可作为IL 6活性及sIL 6R水平高的多发性骨髓瘤患者的有效治疗药物     

自制磷酸钙骨水泥人工骨修复骨缺损的实验研究

目的　观察自制水泥型羟基磷灰石 (CPC)人工骨修复兔桡骨大段骨缺损的成骨效果。方法　将自制的CPC人工骨植入新西兰兔桡骨大段骨缺损模型中 ,术后 4、8、12、16周取材 ,采用HE染色和Masson三色染色分析评价骨缺损修复效果。结果　CPC植入后 4周有新生软骨形成及未成熟的骨组织 ,可见大量的软骨细胞、成骨细胞、胶原组织及较多的小血管。 8～ 16周新骨继续生成 ,人工骨逐渐改建为成熟的板层骨、骨小梁和髓腔结构。结论　自制CPC人工骨有良好的生物相容性和成骨效果 ,可能是一种较理想的骨移植替代材料     

多发性骨髓瘤患者T细胞亚群及白细胞介素-2水平变化的研究

为了进一步了解多发性骨髓瘤患者细胞免疫状态,应用SPA-Ig直接花环法检测了25例MM患者外周血T细胞亚群,用小鼠胸腺细胞增殖法检测患者外周血淋巴细胞白细胞介素—2的产生能力。结果表明MM患者外周血OKT_3~+、OKT_4~+细胞减少,OKT_8~+细胞升高,OKT_4/OKT_8比值下降;外周血淋巴细胞IL-2水平升高,活动期与缓解期之间有差异,缓解期有所下降。但仍高于正常组。提示患者T细胞亚群失衡,IL-2的产生异常,说明患者在疾病过程中存在细胞免疫紊乱状态。     

自体外周血造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤的临床疗效

目的分析自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)治疗多发性骨髓瘤的疗效和安全性。方法 2007年1月至2009年4月对我院6例Durie分期为ⅡA~ⅢB期的多发性骨髓瘤患者实施APBSCT,其中男性5例,女性1例,中位年龄47.5岁(39~56岁)。结果 6例患者均获得造血重建,造血重建中位时间23 d(11~62 d)。移植相关并发症包括发热4例,口腔黏膜溃疡或糜烂3例,转氨酶升高3例,其中1例伴有黄疸,恶心呕吐3例,口腔黏膜血疱1例,腹泻1例。中位随访时间13个月(6~28个月),1例患者于移植后第6个月死于肺部感染,有2例复发,分别在移植后第11个月和第20个月,前者于复发后第4个月死亡,后者经化疗后再次获得缓解。结论 APBSCT治疗多发性骨髓瘤安全、有效、合并症少;前期诱导化疗阶段应用过马法兰可能是某些患者造血重建延迟的原因之一。     

CD4~+CD25- CD45RB~(high) T细胞转移性肠炎模型的建立

目的建立CD4+CD25-CD45RBhighT细胞转移性肠炎模型,并分析其在炎性肠病中的研究价值。方法流式细胞仪分选和纯化CD4+CD25-CD45RBhighT细胞并通过静脉注射移植到Rag1-/-小鼠,记录每组小鼠体质量变化,根据标准程序制作结肠组织切片进行HE染色检查,分离肠黏膜固有层CD4+T细胞并采用ELISA方法检测TNF-α和IFN-γ的表达水平。结果 CD4+CD25-CD45RBhighT细胞重建Rag1-/-小鼠3周后出现体质量下降,至第6周时体质量下降更加急剧并伴有明显腹泻。结肠组织切片结果发现明显的炎性细胞浸润,结肠上皮出现局灶性溃疡,炎症进一步蔓延至黏膜下层。结肠黏膜固有层CD4+T细胞TNF-α和IFN-γ的表达水平明显高于对照组。结论CD4+CD25-CD45RBhighT细胞转移性肠炎模型在研究炎性肠病的发病机制中具有重要作用。     

重组异种骨对Balb/c小鼠的免疫学影响

目的动态评价小鼠植入重组异种骨后的免疫毒性改变,揭示该重组异种骨的免疫学作用机制。方法以广东冠昊生物科技股份有限公司研发的重组异种骨为材料,进行体外检测该重组异种骨的淋巴细胞转化实验;将重组异种骨植入Balb/c小鼠右侧股部肌间隙,分别通过血生化分析仪、ELISA和流式细胞术,于植入后1周、2周、4周动态监测Balb/c小鼠免疫学改变,综合评价该重组异种骨对机体的免疫学影响。结果通过实验发现,该重组异种骨无明显的体外淋巴细胞免疫刺激作用;异种骨植入小鼠后,其血清中C3、IgG、IgM、炎性因子(TNF-α、IL-6)水平以及植入物局部碱性磷酸酶(ALP)含量均与阴性对照组(即假手术组)无明显差异,且该异种骨植入对小鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及其淋巴结淋巴细胞的分群和活化均无显著影响。结论该重组异种骨不能引起体内外的免疫毒性反应,从而为重组异种骨的临床应用提供实验数据和理论依据。     

椒蒿对自身免疫性睾丸炎小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的影响

目的 研究椒蒿挥发油对自身免疫性睾丸炎小鼠CD4+ CD25+调节性T细胞的影响.方法 雄性BALB/c小鼠80只,随机分为4组(生理盐水组、模型组、橄榄油组、椒蒿组),采用睾丸内注射冰醋酸的方法造模,各组都在手术前3天开始灌胃,手术后继续灌胃,共连续灌胃24 d(盐水组只灌胃,不手术).分别于术后3周、9周取外周血,通过流式细胞仪对CD4+ CD25+调节性T细胞进行检测.结果 术后3周,模型组、橄榄油组、椒蒿组小鼠外周血CD4+ CD25+调节性T细胞百分比均低于生理盐水组,差异有统计学意义(P＜0.05),而此3组之间差异无统计学意义(P＞0.05).术后9周模型组与橄榄油组小鼠外周血CD4+ CD25+调节性T细胞百分比低于生理盐水组,差异有统计学意义(P＜0.0S),椒蒿组与生理盐水组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 椒蒿能使自身免疫性睾丸炎小鼠CD4+ CD25+调节性T细胞百分比提高,后者可发挥免疫调节作用.     

两种注射型载体材料负载骨形态发生蛋白对兔前交叉韧带重建术后腱-骨愈合的影响

目的 探讨注射型纤维蛋白胶(FG)、注射型磷酸钙骨水泥(CPC)负载骨形态发生蛋白(bBMP)对前交叉韧带重建术后腱-骨愈合的影响.方法 利用新西兰白兔(n=50)双侧趾长伸肌肌腱重建前交叉韧带(ACL),其中一侧骨隧道与移植肌腱之间的间隙注入复合性材料作为实验组,包括FG-bBMP组(n=25)及CPC-bBMP组(n=25),另一侧作为对照组.分别于术后2、6、12周取材,进行Micro-CT扫描、组织学染色及生物力学检测观察腱-骨之间的愈合状况.结果 影像学结果显示,术后6周,FG-bBMP组骨密度BMD值高于CPC-bBMP组,但术后12周时,CPC-bBMP组腱-骨间BMD值最高.组织学结果显示,术后2周,FG-bBMP组腱-骨间较CPC-bBMP组可见更多的软骨细胞及新生骨;术后6周,FG-bBMP组腱-骨间软骨细胞已逐渐钙化成骨,而CPC-bBMP组腱-骨界面则呈现新生骨组织向肌腱方向长入;术后12周,CPC-bBMP组腱-骨间隙被更多的新生骨和新生软骨填充,而FG-bBMP组新生骨已明显成熟.对照组术后腱-骨间一直被纤维样结缔组织连接.生物力学结果同样证实,FG-bBMP组和CPC-bBMP组的最大牵拉力均显著高于对照组(P<0.05).结论 FG-bBMP和CPC-bBMP复合物均能促进腱-骨间的愈合,但FG-bBMP组腱-骨间新生骨生成具有爆发效应,而CPC-bBMP组腱-骨间新生骨生成则呈现缓慢上升的趋势.     

Flavopiridol诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的分子机制

目的探讨flavopiridol诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的分子机制。方法以TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot测定Mcl-1、CyclinD2、Bcl-XL、Bag-1和XIAP等。结果在临床剂量的flavopiridol浓度下,MM细胞系在加药后3 h内出现快速凋亡。不同剂量的flavopiridol均可快速诱导Mcl-1表达下调和CTD磷酸化的抑制,flavopiridol抑制CTD磷酸化的剂量与其抑制Mcl-1表达的剂量密切相关。该剂量也是其诱导MM细胞凋亡的剂量。转录抑制因子放线菌素D及flavopiridol均能抑制Mcl-1表达,并可诱导原代MM细胞凋亡。结论转录抑制因子放线菌素D和CDK抑制剂flavopiridol诱导MM细胞凋亡可能与其抑制CTD磷酸化,从而抑制Mcl-1的mRNA以及蛋白质水平有关。     

髓样细胞白血病-1基因在多发性骨髓瘤发病中的分子机制

目的通过检测骨髓瘤细胞中依赖IL-6与否的髓样细胞白血病-1(mcl-1)基因的表达,阐明mcl-1基因在多发性骨髓瘤发病中的信号转导通路。方法应用JAK特异性抑制剂AG490、蛋白激酶抑制剂LY294002、ERK1/2信号通路的特异性阻断剂PD98059,分别研究了JAK/STAT通路、ras/MAPK通路及PI3K/Akt三大信号途径与mcl-1基因在多发性骨髓瘤中的关系。结果在骨髓瘤细胞8226和U266中,抑制ERK1/2活性不能改变mcl-1的表达;高浓度的AG490不能抑制STAT3的酪氨酸磷酸化;LY294002可抑制8226细胞和ANBL-6细胞的增殖,但不抑制mcl-1的表达。结论 Ras/MAPK通路以及PI3K通路在mcl-1基因的调节中无作用,但STAT的作用仍然需要进一步探讨。     

蜂斗菜素诱导骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡及其机制

目的观察蜂斗菜素对骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法采用锥虫蓝拒染法检测蜂斗菜素对RPMI 8226细胞的增殖抑制作用,TUNEL法检测蜂斗菜素诱导的RPMIS226细胞凋亡,Hochest33258荧光染色法观察细胞核的变化,Western blot技术检测Caspase-3、8、9蛋白表达和MEK/ERK、p38MAPK蛋白磷酸化水平。结果蜂斗菜素作用24、48、72h后对骨髓瘤RPMI 8226细胞均有显著的增殖抑制作用(P均<0.01);蜂斗菜素呈时间和浓度依赖地诱导骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡(P<0.05,P<0.05),Caspase抑制剂预处理可明显抑制细胞凋亡;蜂斗菜素作用72h后,Caspase-3、8、9蛋白表达显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.05),ERK1/2及MEK蛋白磷酸化水平显著下降(P<0.01,P<0.05),p38MAPK蛋白磷酸化水平显著上升(P<0.01)。结论蜂斗菜素能够抑制骨髓瘤RPMI 8226细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与Caspase-3、8、9蛋白激活,ERK/MEK及p38MAPK蛋白磷酸化改变有关。     

新型疫苗治疗急性白血病及多发性骨髓瘤的临床研究

目的　探讨新型疫苗主动治疗急性白血病及多发性骨髓瘤的疗效及毒副作用。方法　应用基因工程生产的细胞因子和急性白血病及多发性骨髓瘤肿瘤细胞制备的疫苗 ,主动免疫治疗急性白血病 7例、多发性骨髓瘤37例。结果　 37例急性白血病患者中化疗未缓解或化疗不能耐受者 2 9例 ,经疫苗治疗达到完全缓解者 5例占17.3% ,部分缓解者 6例占 2 0 .7% ,微效者 4例占 13.8%。总有效率 5 1.8%。化疗缓解组 8例疫苗治疗后维持缓解达 8～ 13个月复发。多发性骨髓瘤 7例 ,其中 1例完全缓解 ,5例部分缓解。治疗中未发现明显副作用。结论　应用新型疫苗治疗化疗无效或化疗不能耐受的急性白血病及多发性骨髓瘤具有肯定疗效。且经济简便 ,无明显毒副作用     

NK细胞杀伤ARH-77细胞的活性及机制的初步探讨

目的探讨同种异体NK细胞杀伤人骨髓瘤ARH-77细胞的活性及机制。方法 LDH释放法检测NK细胞杀伤ARH-77细胞的活性;RT-PCR方法和流式细胞仪分别检测K562和ARH-77细胞NKG2D配体和HLA-I基因和分子。阻断K562和ARH-77细胞NKG2D配体,观察NK细胞杀伤活性的变化。结果相同效靶比时NK细胞杀伤ARH-77细胞的活性明显低于杀伤K562细胞。两种细胞均表达MICA/B和ULBP1～3基因。K562细胞高表达MICA/B和ULBP1～3分子,不表达HLA-Ⅰ类分子;ARH-77细胞低表达ULBP1～3分子,高表达HLA-Ⅰ类分子。ARH-77细胞HLA基因型为A2、3,B15、35,Cw3、4。阻断NKG2D配体,NK细胞对K562细胞的杀伤活性明显降低,对ARH-77细胞的杀伤活性无明显改变;阻断HLA-Ⅰ类分子后,NK细胞对K562细胞的杀伤活性无变化,对ARH-77细胞的杀伤活性明显提高。结论 ARH-77细胞对NK细胞的杀伤敏感性低,其机制与其高表达HLA-Ⅰ类分子、低表达NKG2D配体有关。     

利用血清蛋白质组差异分析多发性骨髓瘤的耐药机制

目的应用弱阳离子交换纳米磁珠(WCX-MB)分离血清蛋白并联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,对比分析临床上难治复发与治疗敏感的多发性骨髓瘤(MM)患者血清蛋白质组的差异,以期为阐明多发性骨髓瘤的耐药机制提供线索。方法选择临床确诊的19例MM患者,按实际疗效分为难治复发组(11例)和治疗敏感组(8例),以WCX-MB捕获各自的血清蛋白质组分,MALDI-TOF-MS检测蛋白质谱,再利用ClinprotoolsTM 2.2软件进行数据分析,筛选出与耐药相关的差异蛋白质分子。结果在分子量0.7～10ku的范围内,共得到59个有统计学意义的差异多肽峰(P<0.05);与治疗敏感组相比,难治复发组MM患者的血清多肽峰有34个表达上调,有25个表达下调;将区分难治复发组与治疗敏感组MM患者能力最强的10个质谱峰建成了一个诊断GA模型,其灵敏度及特异性均为100%。结论利用CLINPROT系统筛选血清差异表达蛋白能够为研究多发性骨髓瘤的耐药机制和临床预后判定提供有价值的线索。     

多发性骨髓瘤MMSA-1抗原的二级结构预测及多克隆抗体的制备

目的 运用生物信息学技术研究人多发性骨髓瘤MMSA-1(GenBank:AY952881)基因表达蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,并制备多克隆抗体.方法 应用DNAStar Protean软件提供的模块分析和预测MMSA-1蛋白的二级结构和B细胞抗原表位.采用多通道同步固相全自动合成系统合成15肽,免疫健康新西兰成年家兔,制备相应的多克隆抗体.结果 MMSA-1蛋白含有较多的β折叠和转角结构.综合柔韧性、亲水性、抗原性、表面可能性、二级结构、偶联难易及实验难度等因素,选取了MMSA-1蛋白序列318～333位作为抗原表位,即SSSLLPQSPAPTEHL,15肽合成产物经HPLC纯化和质谱检测,纯度达到98.65%,序列正确.免疫兔子获得血清抗体采用层析柱纯化,ELISA检测效价:1∶6000.结论 本研究为基于人MMSA-1抗原表位手段的免疫治疗研究提供了理论依据.     

MDM2/p53通路对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡的调控

目的研究MDM2/p53通路对多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的调控作用及机制。方法体外培养人MM细胞株(RPMI 8226)并分为实验组(Nutlin-3a)和对照组(药物溶剂),采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况和抑制率,Western blot检测凋亡相关蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,24、48、72 h时间点实验组细胞增殖明显降低,抑制率明显增高(P<0.05);实验组MDM2和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),而p53的表达水平明显升高(P<0.05)。实验组各时间点凋亡率(38.42%、82.26%、82.74%)均明显高于对照组(4.80%、8.06%、14.69%)。结论 MDM2与p53之间构成降解-反式激活循环通路影响下游凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,抑制MM细胞的增殖,促进MM细胞凋亡。