人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以EcoRⅠ和BamHⅠ将腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%～94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10~(13)vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的hTSHR289蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。     

携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建

目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒,为探讨AcSDKP(乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸)的多样化功能提供基础。方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板,PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段,插入腺相关病毒载体穿梭质粒pSSHG-CMV,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞,包装rAAV-NT4-AcSDKP,RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。结果成功合成NT4-AcSDKP基因,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP,包装获得滴度为3.40×1010 copies/mL的重组腺相关病毒。结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒,为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。     

人神经生长因子重组腺伴随病毒载体的构建

目的　为了研究人神经生长因子 (hNGF)基因导入急性脊髓损伤 (SCI)模型的治疗作用 ,构建并产生重组腺伴随病毒 (AAV)载体。方法　将hNGF外源性核酸片段插入AAV shuffer质粒 pSSHG Neo的KpnⅠ BamHⅠ位点构建AAV。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的pSSHG Neo三质粒磷酸钙共沉淀法在肾胚胎 2 93细胞系中同源重组包装rAAV。使用地高辛标记的斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　成功构建了重组病毒质粒pSSHG/hNGF ,经蔗糖梯度离心法获得rAAV组分 ,梯度稀释测得滴度为 1.4 6× 10 12 PFU·mL-1。结论　成功地制备了人神经生长因子重组腺伴随病毒 (rAAV/hNGF)载体 ,为SCI基因治疗实验奠定了基础。     

CIP2A在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨CIP2A在肝细胞癌中的表达及其与肝癌临床病理特征的关系。方法采用免疫组化法分析CIP2A蛋白在肝癌组织、癌旁肝组织以及正常肝脏组织中的表达分布;采用RT-PCR法检测肝癌组织及其相对应的癌旁肝组织中CIP2A mRNA的转录水平,统计分析CIP2A mRNA的转录水平与肝癌临床病理特征之间的关系。结果 CIP2A阳性表达主要定位于细胞胞质,肝癌组织中阳性表达率为71.7%(43/60);相对应的癌旁肝组织则较少见CIP2A蛋白阳性表达,其阳性率为23.3%(14/60),且阳性染色分布散在稀疏;正常肝组织中未见CIP2A蛋白阳性表达。肝癌组织中CIP2A mRNA的转录水平显著高于其相对应的癌旁肝组织(P<0.05)。CIP2A mRNA转录水平与肝癌直径、肝癌组织病理分化、临床TNM分期以及是否合并肝癌转移(门静脉癌栓浸润以及肝内转移)等临床病理特征显著相关(P<0.05)。结论 CIP2A在肝癌组织中高表达,且与肝癌的恶性临床病理特征密切相关;CIP2A可能成为潜在的肝癌分子标志物或治疗靶点。     

2型腺伴随病毒基因治疗载体的构建

目的　构建一种适用于中枢神经系统疾病的基因治疗载体。方法　以野生型 2型腺伴随病毒 (AAV 2 )质粒pssv9int 及逆转录病毒载体质粒plxsn为基本元件 ,利用重组DNA技术 ,构建了一种通用型AAV载体质粒pssHG Neo。结果　该质粒除含有必备的原核细胞复制子及Ampr 筛选基因外 ,还含有真核细胞筛选基因———Neor 及供插入目的基因的多克隆位点 (MCS) ,在MCS的上游为逆转录病毒的长末端重复序列 (5’LTR) ,具有启动子的功能 ,启动定向插入到MCS的外源目的基因。质粒中的AAV反向末端重复序列 (ITR)具有定点整合于人基因组 1 9号染色体S1位点的特点。结论　AAV载体是具有广阔前景的基因治疗载体     

一种通用型重组2型腺伴随病毒载体的构建及外源基因表达的研究

以野生型2型人腺伴随病毒（AAV－2）基因组载体pSSV9－int-为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础AAV载体pSSV9／MulV－neosv，表达了neo基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素-2cDNA的重组AAV载体pSSV9／MulV－neosv－IL－2，转染A549细胞后表达了人白细胞介素-2基因。为应用腺伴随病毒作基因治疗研究提供了实验基础。     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。     

表达HCV core-Ant的重组慢病毒的构建

目的 构建表达HCV 核心区的重组慢病毒,以探讨HCV感染后该病毒核心蛋白对肝脏干细胞转分化的影响.方法 利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得HCV core-Ant基因克隆,酶切后连入pLenti6/V5-D-TOPO质粒,得到pLenti6/V5-D-HCV core-Ant,连同pLP/VSVG、pLP1和pLP2四质粒共转染293ET细胞,获得了表达HCV core-Ant重组慢病毒.收集病毒上清,大量扩增,用免疫组化法检测目的 基因在Hela细胞的表达.用类似的方法构建了表达EGFP的重组慢病毒并测定其滴度.结果 克隆出HCV core-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;使用表达HCV core-Ant重组慢病毒感染Hela细胞,免疫组化实验证实胞浆有HCV core表达.使用表达EGFP的重组慢病毒感染3T3细胞见到绿色荧光,说明构建慢病毒载体有效.结论 通过分子克隆体外重组技术成功制备了表达HCV core的重组慢病毒,为进一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础.     

人脑源性神经营养因子重组腺伴随病毒的制备

目的　构建并产生人脑源性神经营养因子 (humanbrain derivedneurotrophicfactor ,hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno associatedvirus,AAV)载体。方法　将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG Neo的EcoRI BamHI位点 ,构建重组质粒pSSHG Neo/hBDNF。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的重组质粒 ,三质粒磷酸钙共沉淀法转染 80 %融合的 14 3细胞系 ,包装AAV hBDNF。经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　重组病毒AAV hBDNF滴度约为 4 .86× 10 14 颗粒·L-1。结论　成功制备了重组病毒AAV hBDNF ,为神经退行性疾病基因治疗实验奠定了基础     

肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体的构建

目的 构建肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体.方法 PCR扩增Survivin启动子,构建重组载体pGEMT/pSurv并酶切、测序鉴定.体外化学合成编码FAK shRNA寡核苷酸链并退火互补成双链,构建真核表达载体pGenesil-FAK shRNA并酶切、测序鉴定.用Survivin启动子替换pGenesil-FAK shRNA中的U6启动子,重组为Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体pGenesil-pSurv-FAK shRNA.将pGenesil-pSurvFAK shRNA转染至肝癌细胞系HepG2,观察转染效率.48h后应用RT-PCR法检测转染重组质粒后HepG2细胞中FAK mRNA的表达变化.结果 成功构建了肿瘤特异性Survivin启动子驱动的真核表达载体pGenesil-pSur-FAKshRNA,转染至肝癌细胞HepG2后可明显下调HepG2细胞中FAK mRNA表达水平.结论 以Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体能够有效下调肝癌细胞FAK的表达,为进一步以靶向干扰FAK表达为主要手段的肝癌联合治疗提供实验依据.     

定向基因传递载体pET15b-Z-VP1的构建

目的 在JCV VP1氨基末端插入SPA的IgG结合区(Z区),构建原核表达质粒pET15b-Z-VP1.方法 PCR扩增JCV基因组VP1和SPA基因的Z片段;重组PCR连接Z片段和VP1;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切将Z-VP1片段插入原核表达质粒pET15b.结果经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化,分别得到VP1和Z片段;再用重组PCR将Z片段和VP1连接成Z-VP1重组基因;双酶切将Z-VP1插入pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间,并经酶切鉴定和DNA测序证实.Western blotting证明pET15b-Z-VP1在体外表达重组蛋白VP1-Z.结论成功在VP1氨基末端插入Z区,构建了原核表达质粒pET15b-Z-VP1,并体外表达重组蛋白VP1-Z.