介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

NT4-ADNF-9融合基因原核表达载体的构建

目的　构建神经营养素 (NT4 )与活性依赖性神经营养因子 9(ADNF 9)融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9,为进一步对神经系统退行性疾病基因治疗的研究奠定基础。方法　采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的ADNF 9的cDNA ,将其连接到NT的信号肽和前导序列的 3′端 ,组成融合基因NT4 ADNF 9,再将该融合基因亚克隆于原核表达载体pBV2 2 0 ,构建为pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。结果　经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将ADNF 9重组到NT4信号肽和前导序列的 3′端 ,并将融合基因亚克隆于pBV2 2 0内。结论　成功构建了NT4与ADNF 9融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。     

Construction of expression vector for NT4-ADNF-9 fusion gene

Objective To construct the prokaryotic expression vector bearing fusion gene NT4-ADNF-9 and lay foundation for further study on genetic therapy of neuraseusory deafness. Methods By means of asymmetrical prince/ template, double stranded eDNA of activity dependent neurotrophic factor-9 (ADNF-9) was obtained, which included restriction enzymes sites on the two extremities. ADNF-9 eDNA was ligated to the signal and leader peptides of nenrotrophin 4 (NT4), and the fusion gene was named NT4-ADNF-9. Then it was suheluned into prokaryotic expression vector pBV220, and called pBV220/ NT4-ADNF-9. Results Evidences of DNA sequence analysis and restrtction enzymes digestion showed that we recombined ADNF-9 eDNA to the 3'terminal of the signal and leader peptides of NT4, and the fusion gene was subcluned into pBV220 successfully. Bioactivity of the products was proved that it could support the cell survival and neurite growth in the primary cultures of dorsal root ganglia (DRG) of embryonic day-8 cbicken neurons as compared to the control. Conclusion Prokaryotic expression vector pBV220/NT4-ADNF-9 can be constructed successfully and the bioactivtty is satisfactory.     

乙型肝炎病毒全X基因对HEK293细胞功能的影响

目的克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异。方法应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;Annexin V流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化。结果成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)%和(0.805±0.013)%,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)%和未转染对照组(0.681±0.018)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)%及(21.34±2.16)%,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)%及未转染细胞对照组(11.37±1.58)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用。     

全反式维甲酸对NT2细胞系胶质瘤趋向性的影响

目的研究全反式维甲酸(ATRA)对NT2细胞系胶质瘤趋向性的影响。方法将NT2细胞分为4组:NT2组(未经ATRA干预)、NT2RA1周组(ATRA干预1周)、NT2RA2周组(ATRA干预2周)、NT2RA3周组(ATRA干预3周),采用细胞迁移分析的方法,分别检测其对U87胶质瘤细胞、无血清DMEM培养基以及含100mL/L胎牛血清DMEM培养基的趋向性。结果经ATRA干预的NT2细胞,其胶质瘤趋向性较未经干预组(NT2组)显著提高(P<0.05),对非特异性迁移趋化物如血清等的迁移则较未经干预组显著减少(P<0.05),其中NT2RA2周组胶质瘤趋向性最强,与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论经ATRA干预2周的NT2细胞其胶质瘤特异趋向性显著提高,有望成为临床治疗胶质瘤的新型靶向基因传递载体。     

猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的研究,构建携带猪源性CTLA4Ig融合基因的重组腺病毒载体.方法 分离猪外周血单个核细胞,经RT-PCR扩增pCTLA4胞外段基因.将PCR产物克隆入pGH IgG,阳性克隆以双酶切及测序鉴定.将目的融合基因pCTLA4Ig克隆人腺病毒穿梭载体pSh...     

CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT‘S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS

Ｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ 18(ｈＩＬ 18)ｉｓａｎｅｗｌｙｉｄｅｎ ｔｉｆｉｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｍａｉｎｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｍｏｎｏｃｙｔｅｓａｎｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ.ＴｈｅｃｙｔｏｋｉｎｅｃａｎｉｎｄｕｃｅＴｈ1ｃｅｌｌｓｔｏｓｅｃｒｅｔｅＩＦＮ γ ,ＩＬ 2ａｎｄＧＭ ＣＳＦ .Ｉｔｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｃｙ ｔｏｔｏｘｉｔｙｏｆＮＫａｎｄＣＴＬｃｅｌｌ,ａｎｄａｌｓｏｒｅｄｕｃｅｓｔｈｅｌｅｖ ｅｌｏｆＩＬ 10 .Ｔｈｕｓ,ｔｈｅｒｅｉｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｖａｌｕｅｏｆ…     

IMPROVEMENT OF HUMAN ISLET FUNCTION BY ADENOVIRUS MEDIATED HO-1 GENE TRANSFER

Objective To investigate in vitro heme oxygenase-1 gene (HO-1) delivery to human pancreatic islets by adenovirus vectors. Methods Recombinant adenovirus containing HO-1 or enhanced green fluorescent protein gene(EGFP) was generated by using the AdEasy System. The purified human pancreatic islets were infected with recombinant adenovirus vectors at various multiplicity of infection (MOI). Transduction was confirmed by fluorescence photographs and Western blot. Glucose-stimulated insulin secretion was detected by using Human insulin radioimmunoassay kits and was used to assess the function of human islets infected by recombinant adenovirus.Results Viral titers of Ad-hHO-1 and Ad-EGFP were 1.96×109 and 1.99×109 pfu/mL, respectively. Human pancreatic islets were efficiently infected by recombinant adenovirus vectors in vitro. Transfection of human islets at an MOI of 20 did not inhibit islet function. Recombinant adenovirus mediated HO-1gene transfer significantly improved the islet function of insulin release when simulated by high level glucose. Conclusion Recombinant adenovirus is efficient to deliver exogenous gene into human pancreatic islets in vitro. HO-1 gene transfection can improve human islet function.     

2型腺伴随病毒基因治疗载体的构建

目的　构建一种适用于中枢神经系统疾病的基因治疗载体。方法　以野生型 2型腺伴随病毒 (AAV 2 )质粒pssv9int 及逆转录病毒载体质粒plxsn为基本元件 ,利用重组DNA技术 ,构建了一种通用型AAV载体质粒pssHG Neo。结果　该质粒除含有必备的原核细胞复制子及Ampr 筛选基因外 ,还含有真核细胞筛选基因———Neor 及供插入目的基因的多克隆位点 (MCS) ,在MCS的上游为逆转录病毒的长末端重复序列 (5’LTR) ,具有启动子的功能 ,启动定向插入到MCS的外源目的基因。质粒中的AAV反向末端重复序列 (ITR)具有定点整合于人基因组 1 9号染色体S1位点的特点。结论　AAV载体是具有广阔前景的基因治疗载体     

肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体的构建

目的 构建肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体.方法 PCR扩增Survivin启动子,构建重组载体pGEMT/pSurv并酶切、测序鉴定.体外化学合成编码FAK shRNA寡核苷酸链并退火互补成双链,构建真核表达载体pGenesil-FAK shRNA并酶切、测序鉴定.用Survivin启动子替换pGenesil-FAK shRNA中的U6启动子,重组为Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体pGenesil-pSurv-FAK shRNA.将pGenesil-pSurvFAK shRNA转染至肝癌细胞系HepG2,观察转染效率.48h后应用RT-PCR法检测转染重组质粒后HepG2细胞中FAK mRNA的表达变化.结果 成功构建了肿瘤特异性Survivin启动子驱动的真核表达载体pGenesil-pSur-FAKshRNA,转染至肝癌细胞HepG2后可明显下调HepG2细胞中FAK mRNA表达水平.结论 以Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体能够有效下调肝癌细胞FAK的表达,为进一步以靶向干扰FAK表达为主要手段的肝癌联合治疗提供实验依据.     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学分析

目的 对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1,EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究.方法 将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a( )中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果 均表明重组质粒pET-28a( )-EF-1构建成功.重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.     

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。     

丙型肝炎病毒NS3-NS4基因的表达及鉴定

目的　构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3 NS4全长基因重组质粒并诱导表达 ,鉴定NS3 NS4蛋白的抗原性。方法　应用PCR技术从pUC19/HCV中扩增目的基因 ,构建重组表达质粒 ,进行原核表达 ,用SDS PAGE、ELISA技术对表达产物的抗原性进行鉴定。结果　成功构建、表达了重组质粒pBV2 2 0 /NS3 NS4 ,用 5 0份质控标准血清对表达蛋白质进行抗原性检测 ,与第二代诊断试剂相比 ,总符合率为 96 %。结论　全长NS3 NS4蛋白是一个优势免疫原性区 ,应该是HCVEIA诊断试剂的有效成分。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

人ECK基因外显子3的实验研究

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon 3在肿瘤形成中的作用奠定了基础     

ADENO-ASSOCIATED VIRUS INTRODUCED INTEGRATION AND EXPRESSION OF FOREIGN GENES IN PC12 CELLS

The ability to induce the expression of targetgenes in neurons is a goal of molecular neurobiolo-gy up to now. A variety of means including lipo-somes and recombinant retrovirus vectors and re-combinant adenovirus vectors have been used to ac-coplish this goal. Each method has some specificdisadvantages['J. None can provide reliable andcontinuouk gene expression in neurons of the cen-tral nervous system.Vectors derived from adeno--associaed virus(AAV ) have the potential to stably transducem…     

EXPRESSING HUMAN MATURED BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR GENE IN E. Coli AND DETERMINING ITS BIOACTIVITY

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)is amember of the family of neurotrophins['J. The hu-man BDNF gene is localized on chromosome of1lp13. The nucleotide sequence that is 744bpIength including signal sequence and prosequenceshows an open reading frame to encode a precursorof 247 amino acids. The matured BDNF consists ofll9 amino acids (relative molecular mass of 14Kd,PI~l0)['.'j. The activity of BDNF in the nervoussystem is widespread. BDNF could support the sur-vival of cranial …