TRPC促进肾小球系膜细胞外基质沉积的机制研究

目的 探讨瞬时受体电位阳离子通道(transient receptor potential canonical, TRPC)促进大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积的作用机制。方法 免疫荧光染色方法观察TRPC1和TRPC6在HBZY-1细胞上的定位及表达;给予AngⅡ干预HBZY-1细胞后,应用qRT-PCR和Western blotting方法检测Gαq/PLCβ4/TRPC信号通路关键蛋白和ECM沉积指标[α-SMA、CollagenⅢ(ColⅢ)和Fibronectin(Fn)]的mRNA和蛋白表达;siRNA技术沉默TRPC1和TRPC6表达后,检测ECM沉积指标的表达;Fluo-4AM Ca²⁺成像技术测定细胞内Ca²⁺内流的变化情况。结果 TRPC1和TRPC6在HBZY-1细胞中均有表达,主要定位在细胞膜和胞质。AngⅡ刺激后,可以激活Gαq/PLCβ4/TRPC信号通路,表现为Gαq、PLCβ4、TRPC1和TRPC6的mRNA和蛋白表达均升高(P<0....     

K_(Ca)3.1通道抑制剂TRAM-34对TGF-β1诱导系膜细胞增生的影响

目的观察TRAM-34对TGF-β1诱导系膜细胞增生的影响,了解KCa3.1在肾小球硬化中的作用。方法2ng/mL TGF-β1诱导系膜细胞增生后,采用流式细胞技术和MTT方法观察8、16、24nmol/L TRAM-34分别对细胞周期和细胞增殖的影响,并选用最佳抑制浓度TRAM-34干预15、30、60min后,用RT-PCR技术观察其对系膜细胞α-SMA和FSP-1转录水平的影响。结果与空白对照组相比,2ng/mL TGF-β1诱导的系膜细胞阻滞于G0^G1期,表现为G0G1期,表现为G0^G1期细胞百分比明显升高[(48.45±1.89)%vs.(70.29±1.84)%,P<0.01],而S期细胞百分比相应下降[(38.54±1.13)%vs.(19.56±1.67)%;P<0.01);各浓度TRAM-34组均可以改善阻滞于G0G1期细胞百分比明显升高[(48.45±1.89)%vs.(70.29±1.84)%,P<0.01],而S期细胞百分比相应下降[(38.54±1.13)%vs.(19.56±1.67)%;P<0.01);各浓度TRAM-34组均可以改善阻滞于G0^G1期的系膜细胞增生,使细胞周期中G0G1期的系膜细胞增生,使细胞周期中G0^G1期细胞百分比明显减少,S期细胞百分比明显增多,其中24nmol/L组降低最明显[TGF-β1组vs.TRAM-34组:G0G1期细胞百分比明显减少,S期细胞百分比明显增多,其中24nmol/L组降低最明显[TGF-β1组vs.TRAM-34组:G0^G1期为(70.29±1.84)%vs.(61.90±1.88)%;S期为(19.56±1.67)%vs.(25.52±1.62)%;P<0.05)。MTT实验结果也显示各浓度TRAM-34对TGF-β1诱导系膜细胞增生具有抑制作用,其中24nmol/L组抑制作用最显著,与8nmol/L和16nmol/L组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。24nmol/L的TRAM-34可显著抑制系膜细胞α-SMA和FSP-1的表达。结论 TRAM-34能够改善TGF-β1诱导的系膜细胞阻滞,减少细胞的早衰、表型转化和纤维样增生。     

新基因C1orf63功能的初步研究

目的检测C1orf63基因在肝癌和癌旁组织中的定位,以及C1orf63在多种人肝癌细胞系和人胃癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平;检测干涉C1orf63后对人胃癌细胞MKN28的细胞周期的影响。方法免疫组化染色法检测C1orf63基因在组织中的定位;Real-time PCR和Western blot分别检测C1orf63基因在细胞中的表达;脂质体转染法将干涉片段转染至MKN28细胞中,Real-time PCR和Western blot法筛选有效干涉片段;流式细胞术检测C1orf63干涉后对MKN28细胞的细胞周期的影响。结果 C1orf63在肝癌和癌旁组织细胞中都有胞浆表达,在MKN28细胞中表达量较高,在MKN45细胞中表达量较低;成功筛选出C1orf63基因的有效干涉片段;C1orf63干涉后,胃癌细胞MKN28发生G1期阻滞,经统计学分析,C1orf63干涉后MKN28细胞增殖指数降低(P<0.05)。结论 C1orf63在人肝癌和癌旁组织细胞胞浆中都有表达,在MKN28细胞中表达量最高;干涉C1orf63基因后,可使MKN28细胞发生G1期阻滞,为该基因功能的后续研究奠定了基础。