大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验

目的建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系,进行骨向分化诱导,并将诱导的成骨细胞复合钛网体外成骨,为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。用扫描电镜观察骨向诱导后细胞复合钛网的情况。结果用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。扫描电镜可观察到骨向诱导后细胞复合在钛网表面有矿化的基质沉积。结论成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,MSCs能够向成骨细胞分化,骨向诱导后细胞复合钛网体外有矿化的基质。     

人晶状体上皮细胞原代培养方法的改进

目的 建立一种简单有效的人晶状体上皮细胞体外培养的方法.方法 用组织块培养法,采用连续花瓣状撕囊法获得人白内障患者的晶状体前囊膜,使用含有表皮生长因子的培养液进行培养,对培养的细胞进行形态学观察及鉴定;在倒置相差显微镜下观察其生长规律,应用免疫荧光组织化学法进行鉴定.结果 体外培养的原代人晶状体上皮细胞在组织块贴壁24 h后从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点.αA-晶状体蛋白抗体阳性率几乎100％,鉴定为晶状体上皮细胞.结论 采用连续花瓣状撕囊法获得的组织块较易在体外培养出入晶状体上皮细胞,可用于白内障后囊膜混浊发病机制的进一步研究.     

不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

目的 观察不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞(adiposE-derived stromal cells, ADSCs)生物学特点与年龄的关系,为临床寻找理想的种子细胞并迅速获取所需ADSCs提供实验依据.方法 使用密度梯度离心法分离不同年龄段脂肪间充质干细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,分析脂肪间充质干细胞的纯度,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期.结果 不同年龄段ADSCs均贴壁生长,呈典型ADSCs形态和生长特征,传代细胞的增殖速度比原代细胞快,但随着年龄的增长,原代及传代培养ADSCs的增殖能力下降,生长周期延长.结论 ADSCs的增殖能力和活性随着年龄的增长而降低,但各年龄段ADSCs均可满足临床不同患者组织工程种子细胞的要求.     

乳兔房室结细胞原代培养及形态特征

目的观察房室结细胞体外分散培养及形态学特征。方法取新生3 d乳兔房室结组织采用差速贴壁分离技术加机械破坏非心肌细胞法进行原代细胞培养,观察记录各类培养细胞的生长状况,并进行细胞化学染色。结果在培养的房室结细胞中,至少有4种自发性收缩细胞及少量的不规则细胞和多边形细胞。其中梭形细胞最多,圆形细胞和三角形细胞次之,多角形细胞最少;多角形细胞和圆形细胞收缩频率最高,其次为梭形细胞,三角形细胞收缩频率最低。细胞化学染色显示:三角形细胞肌原纤维最丰富,其次为梭形细胞,多角形细胞和圆形细胞肌原纤维最少。结论兔房室结由多种形态不同的细胞构成,多角形细胞和圆形细胞可能是起搏细胞,梭形细胞可能是过渡细胞,三角形细胞可能是普通心肌细胞。     

姜黄素对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡上皮细胞内质网应激的影响

目的探索姜黄素对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)大鼠肺泡上皮细胞内质网应激的调节作用。方法雄性SD大鼠随机分为正常对照组、COPD模型组、姜黄素干预组和溶剂对照组,采用香烟烟熏联合气管内注射脂多糖的方法建立COPD大鼠模型,并按照分组情况对大鼠进行干预。干预结束后计数支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数量,HE染色观察肺组织病理学改变,透射电子显微镜观察肺泡上皮细胞内质网形态,免疫组织化学法检测葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)在肺泡上皮细胞中的表达水平。结果与正常对照组比较,COPD模型组大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数量均显著升高(P<0.05);姜黄素干预组大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数量较COPD模型组降低(P<0.05)。光镜和透射电子显微镜观察显示COPD模型组大鼠肺泡腔扩张、肺泡上皮细胞内质网肿胀,姜黄素干预可减轻肺泡上皮细胞及内质网损伤。与正常对照组相比,GRP78在COPD大鼠肺泡上皮细胞中表达水平显著升高(P<0.05);姜黄素干预可显著下调GRP78在COPD大鼠肺泡上皮细胞中表达水平(P<0.05)。结论姜黄素可能通过抑制肺泡上皮细胞内质网应激而发挥对COPD的保护作用。     

小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法

目的建立一种操作简便、高纯度的小鼠背根神经节神经细胞原代培养的方案。方法取6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠的背根神经节,使用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化,获取背根神经节神经细胞,采用小鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定并测定细胞纯度。结果培养的原代神经细胞生长良好,纯度可达90%,用含有神经生长因子(NGF)的DMEM培养基培养,存活时间可达60 d。结论该方案简单稳定,可培养出大量高纯度的神经细胞,为深入研究神经细胞提供了可靠的模型。     

小鼠肌源性干细胞的分离、培养及其分化能力检测

目的探讨小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的原代培养方法及其分化潜能,为肌性泌尿组织的细胞修复、治疗奠定基础。方法运用中性蛋白酶(DispaseⅡ)、胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法分离小鼠MDSCs,并运用差速贴壁法进行纯化。倒置显微镜下观察细胞形态,RT-PCR法鉴定MyoD及Desmin的表达,同时对分离的细胞进行成骨、成脂等分化诱导并鉴定。结果运用中性蛋白酶可很好地消化组织,差速贴壁法能得到纯度较高的MDSCs;RT-PCR检测发现MDSCs不表达MyoD以及Desmin,提示其为不同于肌卫星细胞的肌源性干细胞;成骨诱导检测碱性磷酸酶(ALP)染色(+),成脂诱导油红O染色(+);其可自体分化诱导为心肌样细胞,免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白(cTnI)呈现阳性结果。结论利用此分离方法可获得纯度较高且具有较强分化潜能的肌源性干细胞,有助于进一步进行组织工程研究。     

人脾脏巨噬细胞的分离与纯化

目的　探索分离纯化大量人脾脏巨噬细胞 (MΦ)的方法。方法　选取 10例手术切除的脾脏 ,机械研磨法获得脾脏组织细胞混悬液。采用贴壁培养的方法进行MΦ的分离与纯化 ,相差显微镜下动态观察 ,明确贴壁培养的合适时间 ,详细记录MΦ分离纯化过程各步骤所需时间。收获的MΦ ,台盼蓝染色判定活力并计数 ,统计出平均每克脾脏组织收获的MΦ数及其纯度。相差显微镜、透射电镜观察分离纯化MΦ的形态特征。结果　分析贴壁培养各时间段的细胞纯度及活力 ,确定MΦ培养的合适时间为 2～ 3h。贴壁培养纯化后 ,平均从每克脾脏组织可收获 (0 .2 5± 0 .0 3)× 10 8个MΦ ,纯度为 (90± 5 ) % ,细胞活力≥ 99% ,细胞结构及各种细胞器结构均完整。结论　贴壁培养方法分离纯化人脾脏MΦ是成功可行的 ,收获的MΦ数量大、纯度高、活力好 ,为脾脏MΦ功能的深入研究奠定了基础     

β-淀粉样蛋白增加基底前脑神经元对谷氨酸的易感性

目的探讨β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)与谷氨酸(Glu)联合应用,对原代培养的大鼠基底前脑神经元的作用。方法原代培养大鼠基底前脑神经元,应用形态学、MTT法结合ChAT免疫组织化学染色,分别观察Aβ25-35与Glu联合应用,对原代培养的基底前脑神经元存活率、形态学及ChAT免疫反应阳性神经元的影响。结果将100 nmol/L、1μmol/L Aβ分别和20μmol/L Glu联合用于培养的基底前脑神经元,在倒置显微镜下观察,细胞表面粗糙,立体感减弱,胞浆中出现深色颗粒,细胞肿胀或收缩;尼氏染色显示尼氏体减少;MTT检测显示神经元存活率明显下降,100nmol/L Aβ+20μmol/L Glu组与100 nmol/L Aβ组间,1μmol/L Aβ+20μmol/L Glu组与1μmol/L Aβ组间比较均具有统计学差异(P<0.05);ChAT免疫阳性神经元的灰度和截面积均减小。结论Aβ25-35可增加神经元对Glu神经毒性作用的敏感性,表明Glu在阿尔茨海默病发病中起着非常关键的作用。     

神经干细胞的分离培养与鉴定

目的　分离培养新生鼠神经干细胞并获得细胞克隆 ,同时建立良好的传代方法。方法　取新生大鼠大脑室管膜、脑室周围及海马细胞 ,经消化及机械吹打后接种于加有N2添加剂及生长因子的DMEM/F12 培养基 ,悬浮培养 ;用含血清而不含生长因子的培养基贴壁培养 ,促使分化 ;最后用免疫细胞化学方法进行染色鉴定。结果　分离培养的细胞多聚集生长 ,并形成细胞克隆 ,可以传代 ;细胞为圆形或椭圆形 ,经鉴定为nestin抗原阳性 ;分化后细胞分别表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原。结论　分离培养的细胞具有自我更新和多向分化能力 ,表达神经干细胞的特异性抗原nestin ,是神经系统的干细胞。     

体外诱导人脐血CD34~+细胞向肝细胞的分化

目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50 mL/L FBS,1×ITS,4.7 mg/L亚油酸,10-4mol/L 2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16 d时留取细胞。通过RT-PCR对ALB、AFP、GATA-4等mRNA的表达水平进行检测;用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达,并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%,达到分离要求。RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16 d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞,ELISA检测表明诱导组8、16 d培养液中的ALB质量浓度明显增高,与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论在体外培养条件下,脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。     

PROPERTIES OF PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF NEONATAL RAT RETINAL PROGENITOR CELLS IN VITRO

Objective To investigate the properties of proliferation and differentiation of neonatal rat retinal progenitor cells （RPCs） in vitro. Methods RPCs were isolated from neonatal SD rats neural retina and cultured in DMEM/F12 ＋ N2 with EGF and bFGF （suspension medium ） or 10 % FBS without EGF and bFGF （ differentiation medium）. The cells grew as suspended spheres or adherent monolayers, depending on different culture conditions. The neural stem cells or retinal progenitors, neurons, astrocytes, retinal ganglion cells, rod photoreceptors and the proliferating cells were evaluated with immunofluorescence analysis by Nestin or Pax6, Map2, GFAP, Thy-1, Rhodopsin and BrdU antibodies respectively. Results RPCs could propagate and differentiate in suspension or differentiation medium and express the markers of Nestin （92.86%） or Pax6 （86.75%）, Map2 （38.54%）, GFAP （20.93%）, Thy-1 （27. 66%） and Rhodopsin（13. 33%）in suspension medium; however, Nestin （60.27%）, Pax6 （52%）, Map2 （34.94%）, GFAP （38.17%）, Thy-1 （30.84%） and Rhodopsin （34.67%） in differentiation medium. 96.4 % of the population in the neurospheres was BrdU-positive cells. The cells could spontaneously adherent forming some subspheres and retinal specific cell types. Conclusion Neonatal rat RPCs possess the high degree of proliferation and can differentiate into neurons, astrocytes, retinal ganglion cells and rod photoreceptors in vitro. There are different proportions for RPCs to differentiate into specific cell types.     

不同生长期晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞存活的促进作用

目的观察不同生长期大鼠的晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)是否具有不同的保护作用。方法分别提取出生后1 d、2周、6月、1年期的SD大鼠晶状体可溶性蛋白,加入培养的RGCs中,观察其对RGCs存活时间、突触生长状况及凋亡的影响。结果同期提取的晶状体蛋白各不同浓度作用于RGCs,促进其存活的作用有差异,最佳有效浓度为10-5g/L。不同生长期大鼠的晶状体蛋白可以延长RGCs存活时间,并随生长期增长而延长,但1 d组与2周组无显著性差异。加入晶状体蛋白后RGCs凋亡减少,随生长期增长而逐级减少。结论晶状体可溶性蛋白可显著促进离体培养的RGCs的存活和生长,晶状体蛋白的最佳有效质量浓度为10-5g/L。不同生长期晶状体蛋白的神经保护作用有所不同,随生长期延长,作用逐渐增强。     

STUDY ON DIFFERENTIATION OF RATS EMBRYONIC STEM CELLS CULTURED IN BRL-CM INTO NEURAL PRECURSOR CELLS

Embryonicstem (ES)cellsrefertothosesepa ratedfromtheinteriorcellmassthathasnotyetim bedded .Thesetotipotentialcellsareinhighundif ferentiatedstate ,canbecultivatedandproliferateinvitro[1] .Underinductioninvitro ,EScellscanbedifferentiatedintocellsthatbelongtothreeembry oniclayers[2 ] ,suchasmyocardiumcells ,bloodcellsandneuralcells .GeneticoperationscanbedonewithoutlosingfeaturesoftheEScells.Thereforeithasbecomethemaintoolintheup to datedcelltherapy .Becausetheyarelikelytoformteratomawhentr…     

钙依赖途径在高糖致心肌细胞肥大中的作用

目的探讨体外培养条件下钙调神经磷酸酶(CN)和钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是否参与高糖诱导的心肌细胞的肥大反应。方法新生SD大鼠心肌细胞在含150mL/L的新生牛血清培养48h后,换用无血清培养基培养24h,然后用正常糖(5.5mmol/L的D-葡萄糖)、高糖(25mmol/L的D-葡萄糖)和等渗糖(5.5mmol/L的D-葡萄糖+19.5mmol/L的L-葡萄糖)分别培养48h。检测心肌细胞肥大指标:表面积和蛋白含量;用钙成像技术研究其钙瞬变特点;以及利用CN和CaMKⅡ的阻断剂CsA和KN93验证两种酶在肥大过程中的作用。结果与正常糖组和等渗对照组相比,高糖可以诱导心肌细胞肥大和钙超载,增加了心肌细胞的表面积和蛋白含量。CsA和(或)KN93可明显抑制心肌细胞的肥大。结论 CN和CaMKII在高糖诱导的心肌细胞肥大过程中发挥重要的作用。     

PROTECTIVE ROLE OF SOPHOCARPINE IN COXSACKIEVIRUS B3 INFECTION IN CULTURED RAT CARDIOMYOCYTES

Objective To observe the anti-CVB3 ( Coxsackievirus B3 ) effect of sophocarpine (SC) extracted from Sophora flavescens , a traditional Chinese herb in vitro. Methods Cardiomyocytes from the neonatal rat were cultured to establish the viral myocarditis model. The cells were divided into four groups: infected group ( infected by CVB3 ), SC treated group ( added SC 100 μg/mL after viral infection ), SC control group ( added SC 100μg/mL only), and normal control group. The cytopathic effect (CPE) and the beating frequency of the myocardial cells were observed and the LDH levels in the supernatant were measured at day 2, 3, and 5. The cultured myocytes were added different concentrations of SC ( 12.5 - 400 μg/mL ) after infection with CVB3, the CPE was observed and the concentrations of LDH were measured and compared at day 2, 3, and 5. Results In the SC treated group ( 100 μg/mL) , the cytopathic effect was lighter and the LDH level was lower than the infected group. SC in a concentration of 12.5 - 300 μg/mL could relieve the CPE and lower the LDH level, while in a higher concentration (400 μg/m) , it exacerbated the CPE caused by the virus, and the LDH levels were higher than the infected cells.Conclusion SC in certain concentration could protect the cultured rat cardiomyocytes from CVB3 infection.     

骨髓间质干细胞的分离培养与鉴定

目的建立兔骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。方法抽取兔胫骨骨髓,密度梯度离心,得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性。通过免疫荧光组织化学、流式细胞分析和透射电镜鉴定细胞。结果分离培养的骨髓MSCs贴壁、呈梭形,原代细胞呈集落生长,7～10d达到融合,传代后增殖速度加快;骨髓MSCs表达CD90,反复传代后表达效率增高,不表达CD34;透射电镜可见细胞表面有大量的绒毛突起,胞浆中有丰富的粗面内质网和线粒体,核大,形态不规则。结论密度梯度离心结合贴壁法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,分离培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。