幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。     

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定

目的 克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2(UBC E2)全长编码序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做充分准备.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBC E2基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,并使用Western blotting分析其免疫反应性.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-UBC E2构建成功,该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达,十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL-21/DE3得到高效表达,亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明其有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫UBC E2可在原核表达系统中表达,并具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

JC病毒蛋白VP3原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建JC病毒蛋白VP3原核表达载体,并观察其表达情况.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)获得VP3基因,将其连接到pGEM T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET 32a(+)中,转化BL21大肠杆菌,IPTG诱导,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)、Western blot免疫印迹分析鉴定融合蛋白的表达情况.结果 扩增获得VP3基因片段,成功构建了大肠杆菌原核表达JC病毒VP3载体.经IPTG诱导,得到了分子质量为59 ku的目的 蛋白,Western blot证实其具有良好的抗原性.结论 本研究成功表达了VP3蛋白,对于研究VP3蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了的基础.     

人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。     

结核杆菌DnaA蛋白的原核表达及免疫血清的制备和检测

目的 在大肠杆菌中表达重组结核杆菌DnaA蛋白,对表达产物进行纯化、鉴定后制备DnaA蛋白特异性免疫血清并进行Western blot检测.方法 以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组为模板,PCR扩增DnaA基因,构建DnaA原核表达质粒pET-DnaA,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表...     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板,扩增Hp UreI基因片段,将目的基因UreI与载体pET32a( )分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切,纯化,连接。筛选阳性重组载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达pET32a( )/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp UreI编码基因,由585 bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致,无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a( )/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白分子量为130 ku,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,Western blot分析显示,该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a( )/UreI,并在原核细胞中得到了高效融合表达。     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学分析

目的 对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1,EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究.方法 将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a( )中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果 均表明重组质粒pET-28a( )-EF-1构建成功.重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.     

丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒（HCV）1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物，采用巢式PCR法，从含HCV1bDY株全长eDNA的质粒HCV17中扩增出约480bp的目的片段，将其插入克隆载体pMD18-Tvector中，再亚克隆到原核表达载体pET-28a中；经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达；采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白的表达水平。结果成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体，并得以表达。结论成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因，为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的Ns5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。     

迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定

目的 构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因.方法 采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)中克隆出V_H和V_L可变区基因, 再通过重叠延伸拼接PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly_4ser)_3,体外构建单链抗体基因;将其克隆至表达载体pET-28a并在大肠杆菌中表达,表达产物纯化后,用SDS- PAGE、Western blot及ELASA进行鉴定.结果 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、纯化和体外复性,获得了高纯度的单链抗体片段,重组蛋白的分子质量为27 ku.ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力.结论 成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv,为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础.     

人B7.2(CD86)胞外区原核表达及其工程菌发酵培养的实验研究

目的　利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)并对工程菌发酵培养条件进行优化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术从B7.2cDNA全长中克隆B7.2 (IgV +C) ,将PCR产物克隆入表达载体 pGEX 4T 3从而得到重组体 pGEX 4T 3 /hB7.2 (IgV +C) ,SDS PAGE及Westernblot用于检测目的蛋白的表达 ,同时对目的蛋白诱导表达时间及诱导剂浓度进行优化 ,对重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果　Westernblot结果显示相应分子质量 5 5kD处有hB7.2 (IgV+C)与GST融合蛋白的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。对工程菌进行发酵培养研究的结果表明 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,未见质粒丢失 ,目的蛋白的表达不受影响 ,且在 3 7℃诱导 5h、IPTG终浓度为 4mmol·L- 1 时其表达量最多。结论　证明了利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)的可行性。     

新型抗ErbB2、抗CD16三价双特异性抗体的构建及功能鉴定

目的构建一种新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb。方法构建重组载体pET22b( )/BsAb;转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组蛋白的表达,通过包涵体复性纯化蛋白。应用悬浮培养系统扩增稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(CG5细胞)和稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(HG2细胞),通过rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化融合蛋白,应用流式细胞术分析BsAb的结合能力。结果该BsAb可在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达,通过对重组蛋白的复性可获得高纯度的蛋白;复性后的BsAb具有与其亲本抗体相似性的结合靶抗原的能力。结论新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb能与高表达ErbB2的乳腺癌细胞系SKBR3细胞高亲和力结合和表达CD16的人外周血单个核细胞低亲和力结合。     

猴细小病毒Vp2的克隆、表达和鉴定

目的　克隆、表达和鉴定猴细小病毒 (simianparvovirus,SPV)Vp2蛋白。方法　用设计的SPVVp2区的特异性引物 ,PCR法扩增SPVVp2基因DNA片断 ;将获得的基因片断插入 pThioHisA载体中 ,转化大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切和核酸序列分析技术鉴定重组质粒 ;以LB培养液培养转化有插入SPVVp2基因的pThioHisA载体的大肠杆菌 ,以终浓度 1mmol·L -1的IPTG诱导蛋白的表达 ;用SDA PAGE和Westernblot分析和鉴定表达的蛋白。结果　经限制性内切酶酶切和核酸序列分析 ,获得了插入pThioHisA载体框架的SPVVp2基因的表达质粒 ;阳性转化大肠杆菌在IPTG诱导下获得了SPVVp2蛋白的表达 ;SDA PAGE和用抗 Thio及抗 SPVVp2的特异性抗体的Westernblot分析证实了表达蛋白的特异性。结论　获得了SPVVp2基因的表达质粒并在大肠杆菌中得了高效表达 ,为进一步建立SPV感染的检测方法和研究SPV的血清流行病学等奠定了基础。     

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的　扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法　从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果　VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论　构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。