亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学分析

目的 对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1,EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究.方法 将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a( )中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果 均表明重组质粒pET-28a( )-EF-1构建成功.重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.     

HPV-6/11 L1/E6、HPV-6/11 L1/E7嵌合DNA疫苗质粒的构建

目的　构建HPV 6 / 11L1/E6、HPV 6 / 11L1/E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法　运用PCR扩增HPV 6 /11L1、E6、E7序列 ,PCR产物连接至pGEMT Easy质粒 ,测序鉴定正确后 ,分别连接至真核表达载体pVAX ,再用酶切、连接而构建成HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX质粒。运用电穿孔法将所获得质粒转染COS 7细胞 ,免疫组化检测蛋白表达情况。结果　所构建质粒的插入目的片段测序正确 ;免疫组化检测在胞浆胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论　所构建的HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX融合蛋白表达质粒可在体外表达L1 E6 /L1 E7蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的动物实验及临床实验研究做好准备     

酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7蛋白在NIH/3T3细胞中的表达和定位

目的　将带有人乳头瘤病毒 1 6型 (湖北株 )E7基因的真核表达载体 pL(E7 HB)SN导入NIH/3T3细胞进行瞬时表达。方法　重组质粒转染 3T3细胞通过DNA 磷酸钙共沉淀法 ;E7基因表达的检测采用RT PCR和间接免疫荧光实验。结果　E7基因导入真核细胞后能有效转录并表达E7蛋白 ,通过免疫荧光染色可看到E7蛋白主要定位在胞浆中 ,细胞核中也有 ,但量较少。结论　这可能和湖北株HPV1 6E7基因发生突变有关。     

HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L1 PROTEIN CAN BE EXPRESSED IN LIVE ATTENUATED SHIGELLA FLEXNERI 5A STRAIN SH42

Cervicalcanceristhesecondmostcommon canceramongwomenworldwide,anditaccountfor thehighestmortalityindevelopingcountries.There areabout600000newcasesdiagnosedanditcauses aboutaquartermillionwomendeathperyear[1]. Highrisktypehumanpapillomavirusinfection (suc…     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

放射诱导p16基因胰腺癌靶向性表达的研究

目的　构建 pcDNA3.1 Egr.1p-p16重组质粒并检测其在人胰腺癌 JF305细胞中的辐射诱导表达。方法　将人p16 cDNA基因连接到有辐射诱导特性的早期反应因子 Egr.1p的下游,构建成 pcDNA3.1 -Egr.1p- p16 重组质粒,利用脂质体介导转染人胰腺癌细胞系 JF305 细胞;采用 RT- PCR方法和 Western blot方法检测不同剂量 X射线照射后,被转染细胞中 p16 的转录和表达水平。结果　酶切鉴定证实 pcDNA3. 1 Egr. 1p -p16 重组质粒构建正确。被pcDNA3.1 Egr.1p -p16重组质粒转染的人胰腺癌 JF305细胞经不同剂量 X射线照射后,p16 基因表达均高于未照射组。结论　X射线可诱导 pcDNA3.1 -Egr.1p -p16重组质粒在人胰腺癌 JF305细胞中表达增强。     

原癌基因Fra-1高表达与乳腺癌细胞转移表型的关系

目的研究原癌基因Fra-1与人乳腺癌细胞系MCF-7细胞侵袭及迁移的关系。方法提取乳腺癌细胞系MDA231细胞的总RNA,通过RT-PCR扩增Fra-1全长基因,将其克隆入pcDNA3.1(-)myc-his表达载体;应用脂质体法转染MCF-7细胞,观察Fra-1过表达对MCF-7细胞增殖、黏附和迁移的影响。结果高表达Fra-1增强了MCF-7细胞的增殖、黏附和迁移的能力。结论原癌基因Fra-1可能通过促进肿瘤细胞的增殖、黏附和迁移,在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥作用。     

HSV-1截短gB基因DNA疫苗的构建及初步鉴定

目的　为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法　用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM -T中介载体 ,将其插入到真核表达质粒pcDNA 3 1 (+)的CMV启动子下游。结果　构建的重组真核表达质粒可在动物体内正确表达目的基因 ,对HSV - 1病毒攻击具有免疫保护作用。结论　本研究对截短HSV - 1 gB基因DNA疫苗进行了初步的探索性研究 ,也为多价HSV 1DNA疫苗的构建奠定了基础。     

人B7.2(CD86)胞外区原核表达及其工程菌发酵培养的实验研究

目的　利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)并对工程菌发酵培养条件进行优化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术从B7.2cDNA全长中克隆B7.2 (IgV +C) ,将PCR产物克隆入表达载体 pGEX 4T 3从而得到重组体 pGEX 4T 3 /hB7.2 (IgV +C) ,SDS PAGE及Westernblot用于检测目的蛋白的表达 ,同时对目的蛋白诱导表达时间及诱导剂浓度进行优化 ,对重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果　Westernblot结果显示相应分子质量 5 5kD处有hB7.2 (IgV+C)与GST融合蛋白的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。对工程菌进行发酵培养研究的结果表明 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,未见质粒丢失 ,目的蛋白的表达不受影响 ,且在 3 7℃诱导 5h、IPTG终浓度为 4mmol·L- 1 时其表达量最多。结论　证明了利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)的可行性。     

EXPRESSING HUMAN MATURED BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR GENE IN E. Coli AND DETERMINING ITS BIOACTIVITY

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)is amember of the family of neurotrophins['J. The hu-man BDNF gene is localized on chromosome of1lp13. The nucleotide sequence that is 744bpIength including signal sequence and prosequenceshows an open reading frame to encode a precursorof 247 amino acids. The matured BDNF consists ofll9 amino acids (relative molecular mass of 14Kd,PI~l0)['.'j. The activity of BDNF in the nervoussystem is widespread. BDNF could support the sur-vival of cranial …     

CLONING SEGMENT SPIKE PROTEIN GENE OF SARS-COV AND ITSEXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI

Objective Expressing and purifying the seglnent of SARS-CoV spike protein in E. Coli Methods The target gene was obtained by RT-PCR. The PCR product was cloned into pEGM- T Easy Vector, sequencing and double restriction digestion (BamH Ⅰ , Pst Ⅰ) were performed. The target gene was subcloned into PQE30 expression vector. The gene was expressed in the E. coli strain M15 cells induced by IPTG. The protein was purified with a nickel HiTrap chelating metal affinity column. Results The recombinant expression plasmid was successfully constructed and the protein was well expressed in E. coli strain M15 cells. The ideal pure protein was obtained by purification. Western blotting analysis suggested the protein could act with the convalescent sera of lab confirmed SARS patients. Conclusion The segment of SARS-CoV spike protein was well expressed and purified, and can be applied in diagnosis and immunological research of SARS.     

截短血小板生成素cDNA在中华仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　将具有全长血小板生成素 (TPO)活性的N端截短血小板生成素cDNA(T1 84)作为目的基因 ,在中华仓鼠卵巢细胞 (CHO)中成功表达。方法　将N端截短血小板生成素cDNA克隆入以二氢叶酸还原酶 (DHFR)为筛选扩增基因的 pDC B真核表达载体 ,通过不断提高MTX浓度 ,促进N端截短血小板生成素在CHO细胞中的表达。结果　构建了N端截短血小板生成素cDNA的真核表达质粒 ,并能在CHO细胞中高效表达。结论　N端截短血小板生成素cDNA在CHO细胞中成功表达 ,其产物具有全长TPO的活性。     

丙型肝炎病毒NS3-NS4基因的表达及鉴定

目的　构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3 NS4全长基因重组质粒并诱导表达 ,鉴定NS3 NS4蛋白的抗原性。方法　应用PCR技术从pUC19/HCV中扩增目的基因 ,构建重组表达质粒 ,进行原核表达 ,用SDS PAGE、ELISA技术对表达产物的抗原性进行鉴定。结果　成功构建、表达了重组质粒pBV2 2 0 /NS3 NS4 ,用 5 0份质控标准血清对表达蛋白质进行抗原性检测 ,与第二代诊断试剂相比 ,总符合率为 96 %。结论　全长NS3 NS4蛋白是一个优势免疫原性区 ,应该是HCVEIA诊断试剂的有效成分。     

THE CONSTRUCTION OF LEUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID PCDNA3/HPV16E6 AND EXPERIMENTAL OBSERVATION OF NAKED DNA INJECTED INTO ANIMAL

Cervicalcancerisacommonmalignancyofmarriedwomen.HighriskHPV(HPV16,18)infectioniscloselyassociatedwithcervicalcancer(l).HPV16DNAcanbedetectedinapproximately50%~90?rvicalcarcinomastZ).HPV16E6andE7geneshasbeenprovedtobetransforminggenes.TheirgeneproductscanbindtoandinactivateP53andPRbrespectively,playingacausalroleinthedevelopmentofcervicalcarcinomat27.AlotofinvestigationindicatethatHPV16E6/E7wereconsistentlyandhighlyexpressedincervicalcarcinomas,andthatE6/E7proteinscouldinducebothhu…     

重组小鼠血管抑素基因在胆囊癌细胞中的表达及对血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的　研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞能否表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白。方法　应用脂质体LipofectAMINE 2 0 0 0将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC SD ,G4 18抗性筛选 ;以Westernblot检测血管抑素的表达 ,以血管内皮细胞增殖分析检测其活性。结果　经Westernblot检测 ,得到高表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆 ,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖 (P <0 .0 5 )。结论　小鼠血管抑素基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转导的胆囊癌细胞能够表达具有生物学活性的血管抑素蛋白 ,在胆囊癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值     

一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用

目的建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值。方法将含有目的质粒的菌株扩增后,运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取,微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率。结果改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2 mg/L菌液,A260/280=1.91;内切酶酶切完全;质粒DNA以超螺旋结构为主;真核细胞转染效率为20%左右。结论改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用,获得质粒DNA产量多、质量高,能达到分子生物学常规实验的要求。     

血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达

目的　克隆人血小板生成素 (hTPO)基因 ,并使其在原核细胞中获得表达。方法　先从人胚胎肝脏中提取总RNA ,进行RT -PCR获得编码氨基端 1 95个氨基酸残基的hTPO1 95cDNA。将该片段亚克隆至pGEM -Teasy克隆质粒中 ,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将hTPO1 95cDNA插入到原核表达质粒 pET2 8-a中 ,转化大肠杆菌BLR2 1 (DE3) ,进行诱导表达 ,以SDS -PAGE方法及免疫印迹法进行检测。结果　得到的hTPO1 95cDNA与文献报道的序列完全一致。经诱导后hTPO基因在大肠杆菌中获得表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白约 1 0 % ,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论　得到hTPO1 95cDNA ,并在原核细胞中获得表达 ,得到截短形式的rhT PO1 95。     

新型抗ErbB2、抗CD16三价双特异性抗体的构建及功能鉴定

目的构建一种新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb。方法构建重组载体pET22b( )/BsAb;转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组蛋白的表达,通过包涵体复性纯化蛋白。应用悬浮培养系统扩增稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(CG5细胞)和稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(HG2细胞),通过rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化融合蛋白,应用流式细胞术分析BsAb的结合能力。结果该BsAb可在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达,通过对重组蛋白的复性可获得高纯度的蛋白;复性后的BsAb具有与其亲本抗体相似性的结合靶抗原的能力。结论新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb能与高表达ErbB2的乳腺癌细胞系SKBR3细胞高亲和力结合和表达CD16的人外周血单个核细胞低亲和力结合。     

Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建Apoptin的原核表达载体,并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法在获得Apoptin融合基因的基础上,成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a( )-Apoptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a( )-Apoptin的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与Apoptin融合蛋白一致。结论Apoptin原核表达载体pET-28a( )-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白,为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。