人骨形态发生蛋白-7重组腺病毒载体的构建

目的为了研究人骨形态发生蛋白-7(hBMP7)导入骨缺损模型中的治疗作用,构建重组腺病毒载体。方法将hBMP7基因全长定向克隆入穿梭质粒pACCMV-plpA,构建pACCMV/rhBMP7穿梭质粒,应用磷酸钙-DNA共沉法将穿梭质粒及包装质粒PJM17共转染293细胞,经细胞内同源重组后,构建骨形态发生蛋白-7重组腺病毒Ad pAC-CMV/rhBMP7。结果成功构建了重组质粒pACCMV/rhBMP7,经293细胞包装后,扩增纯化测定病毒滴度为1×1011pfu/mL。结论成功构建人骨形态发生蛋白-7重组腺病毒Ad pACCMV/rhBMP7,为骨缺损、骨不连的基因治疗奠定了基础。     

经皮注射骨形态发生蛋白复合PVP载体修复股骨头骨缺损的实验研究

目的　研究经皮注射骨形态发生蛋白 (BMP)复合可溶性载体聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)是否能促进股骨头骨缺损的修复 ,探讨治疗股骨头骨缺损的新方法。方法　将 2 0只成年兔犬股骨头部制成骨缺损模型 ,实验分四组 ,注射BMP与PVP复合组 ,单纯注射BMP组 ,自然修复组和正常组。通过X线片、组织病理学、碱性磷酸酶、新生骨钙磷含量测定和生物力学等手段检测其成骨性能。结果　注射BMP PVP组术后 1 2周全部发生骨性愈合 ,而单纯注射BMP及自然修复组无 1例发生骨性愈合。结论　经皮注射BMP PVP复合物具有促进骨修复的作用 ,有可能成为治疗骨缺损的一种方法。     

两种注射型载体材料负载骨形态发生蛋白对兔前交叉韧带重建术后腱-骨愈合的影响

目的 探讨注射型纤维蛋白胶(FG)、注射型磷酸钙骨水泥(CPC)负载骨形态发生蛋白(bBMP)对前交叉韧带重建术后腱-骨愈合的影响.方法 利用新西兰白兔(n=50)双侧趾长伸肌肌腱重建前交叉韧带(ACL),其中一侧骨隧道与移植肌腱之间的间隙注入复合性材料作为实验组,包括FG-bBMP组(n=25)及CPC-bBMP组(n=25),另一侧作为对照组.分别于术后2、6、12周取材,进行Micro-CT扫描、组织学染色及生物力学检测观察腱-骨之间的愈合状况.结果 影像学结果显示,术后6周,FG-bBMP组骨密度BMD值高于CPC-bBMP组,但术后12周时,CPC-bBMP组腱-骨间BMD值最高.组织学结果显示,术后2周,FG-bBMP组腱-骨间较CPC-bBMP组可见更多的软骨细胞及新生骨;术后6周,FG-bBMP组腱-骨间软骨细胞已逐渐钙化成骨,而CPC-bBMP组腱-骨界面则呈现新生骨组织向肌腱方向长入;术后12周,CPC-bBMP组腱-骨间隙被更多的新生骨和新生软骨填充,而FG-bBMP组新生骨已明显成熟.对照组术后腱-骨间一直被纤维样结缔组织连接.生物力学结果同样证实,FG-bBMP组和CPC-bBMP组的最大牵拉力均显著高于对照组(P<0.05).结论 FG-bBMP和CPC-bBMP复合物均能促进腱-骨间的愈合,但FG-bBMP组腱-骨间新生骨生成具有爆发效应,而CPC-bBMP组腱-骨间新生骨生成则呈现缓慢上升的趋势.     

慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白筛选稳定转染的兔骨髓间充质干细胞

目的分离、培养并鉴定兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs),探讨慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)感染兔BMSCs的最佳条件,筛选稳定转染的兔BMSCs。方法通过全骨髓贴壁法获得兔BMSCs;茜素红、甲苯胺蓝及油红O染色对BMSCs成骨、成软骨及成脂分化进行鉴定;免疫荧光组化染色检测CD44及CD90的表达;不同浓度嘌呤霉素筛选BMSCs的最小致死浓度;以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为50、100、150、200的慢病毒载体介导eGFP转染BMSCs,倒置显微镜下观察荧光表达,并用嘌呤霉素筛出稳定转染系。结果当MOI为150,慢病毒载体介导eGFP感染兔BMSCs效率最高;嘌呤霉素筛选稳定转染兔BMSCs的最适质量浓度是1.0μg/mL。结论成功培养了兔BMSCs,用慢病毒介导的GFP标记了兔BMSCs并筛选出了稳定转染的兔BMSCs,建立了一个简便有效的干细胞标记方法,为BMSCs在动物体内实验标记示踪奠定了基础。     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

丝裂霉素C与表达Smac/DIABLO的肿瘤靶向腺相关病毒联用对抗恶性黑色素瘤的效果

目的探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导促凋亡因子Smac/DIABLO是否能提高恶性黑色素瘤细胞对丝裂霉素(MMC)的敏感性。方法将携有目的基因的rAAV加入到培养液中转染肿瘤细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,RT-PCR检测Smac/DIABLO基因的表达,MTT法测定肿瘤细胞增殖,流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡;动物在体实验测定抗肿瘤效果。结果 rAAV转染96h后几乎所有细胞表达明亮的黄绿色荧光。RT-PCR检测发现转染48h后目的基因Smac/DIABLO稳定表达。MTT检测显示rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC对肿瘤细胞的抑制率最高(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC组肿瘤细胞的凋亡率明显高于生理盐水(HBSS)组、MMC组和rAAV-hTERT/Smac/DIABLO组(P<0.01)。动物实验结果表明,rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC有非常强的抑制肿瘤作用,其抗癌效果优于HBSS、MMC、rAAV-hTERT/EGFP和rAAV-hTERT/Smac/DIABL组。结论 rAAV-hTERT/Smac/DIABLO在体内、体外均能提高肿瘤细胞对MMC的敏感性。此作用与Smac/DIABLO的促凋亡作用有关。     

骨康宁治疗实验性大鼠骨质疏松的影像与病理对照研究

目的探讨中药骨康宁治疗骨质疏松大鼠的效果。方法5-6月龄雌性SD大鼠,维甲酸复制骨质疏松模型后,给予中药骨康宁治疗。用影像学、骨病理组织学、形态计量学、骨生物力学等实验技术,观察骨康宁的治疗效果。结果经骨康宁治疗后,骨质疏松大鼠的平均骨小梁数、平均骨小梁宽、骨皮质指数、股骨骨密度、股骨的最大变形能力等增加,并明显高于骨质疏松组(P<0.05)。结论骨康宁对维甲酸诱导的大鼠骨质疏松有一定的治疗作用。     

“双骨胶囊”治疗大鼠实验性骨质疏松的效果观察

目的　观察“双骨胶囊”治疗骨质疏松的效果。方法　 5～ 6月龄SD雌性大鼠 ,以维甲酸诱导骨质疏松模型后 ,给予含硼中药“双骨胶囊”进行治疗。用骨病理组织学、形态计量学等实验技术 ,观察“双骨胶囊”的治疗效果。结果　“双骨胶囊”治疗后 ,大鼠的平均骨小梁数 (6 1 0±0 88)、平均骨小梁宽 (75 74± 1 8 3 9)、骨小梁面积百分比 (2 4 0 1± 6 1 4)等指标增加 ,明显高于骨质疏松组 (4 3 3± 0 82 ,41 96± 1 1 6 9,1 6 1 6± 3 0 3 ;P <0 0 5 )。结论　“双骨胶囊”可增加骨量 ,对维甲酸诱导的大鼠骨质疏松有治疗作用     

重组人生长激素、雌激素联合应用对去势大鼠剩余牙槽骨吸收的影响

目的观察重组人生长激素(r-HGH)、雌激素(estrone,E2)及两者联合应用对抗酒石酸酸性酶(TRAP)的活性及剩余牙槽骨骨形态计量学指标的影响,以明确两药单用及联合应用延缓骨质疏松(OP)所致的剩余牙槽骨吸收及其机制。方法通过去除SD大鼠双侧卵巢,拔除单侧上颌磨牙,建立去势大鼠剩余牙槽骨动物模型,建模成功后分为模型组和治疗组,治疗组分别给予r-HGH、E2单用及联合治疗。药物治疗4周及8周后,检测各组血清TRAP含量及形态计量学指标的改变。结果①E2治疗组(ERT)、联合治疗组(Er-HGHT)TRAP含量低于模型组(P<0.05),差异有统计学意义;ERT、Er-HGHT两组TRAP含量基本相同,但都与r-HGH治疗组(r-HGHT)有统计学差异(P<0.05)。②去势可使大鼠剩余牙槽骨的骨小梁面积比减少,宽度减小,髓腔扩大,加速剩余牙槽骨的吸收。r-HGH、E2单用及两者联合应用4周及8周后可提高去势大鼠剩余牙槽骨的骨小梁宽度、骨小梁面积视野百分比,降低骨小梁间隙宽度。结论r-HGH、E2单用及两者联合应用在一定程度上延缓骨质疏松大鼠剩余牙槽骨的快速吸收。     

椎体成形手术单侧与双侧入路治疗老年性骨质疏松压缩性骨折的疗效分析

目的探讨椎体成形术不同手术入路治疗老年性骨质疏松压缩性骨折的临床疗效。方法 2011年2月~2013年6月,98例老年性骨质疏松症并胸腰椎单节椎体压缩性骨折患者进行椎体成形术治疗,根据手术入路不同,随机分为单侧组(48例)和双侧组(50例),前瞻性分析两组患者临床资料,包括性别、年龄、患者受伤到手术的时间、术后随访时间、手术时间,观察骨水泥注入量、椎体前缘高度压缩率(Lee法),测量椎体后凸角度(Cobb角法)及并发症情况,术前、术后1d、术后1年分别采用VAS、ODI(视觉模拟评分法、Oswestry功能障碍指数)评分系统评估患者疼痛情况,比较两组的临床疗效。结果所有患者全部获得完整随访,两组中患者性别、年龄、患者受伤到手术的时间、术后随访时间差异无统计学意义(P>0.05)。单侧组治疗48例,手术时间(34.87±5.91)min,骨水泥注入量(6.20±0.66)mL,术中发现骨水泥渗漏16例(33.3%),椎体前缘高度压缩率改善(10.19±2.12)%,椎体后凸角度改善(13.23°±1.58°);术后1d及1年VAS评分较术前分别改善(4.05±0.12)、(5.42±0.12),术后1年VAS评分较术后1d改善(1.40±0.11);术后1d及1年ODI评分较术前分别改善(35.46±1.89)%、(47.88±2.21)%,术后1年ODI评分较术后1d改善(11.42±0.24)%;术后邻近椎体再发骨折发生10例(20.9%)。双侧组治疗50例,手术时间(41.66±6.90)min,骨水泥注入量(4.88±0.52)mL,术中发现骨水泥渗漏9例(18.0%),椎体前缘高度压缩率改善(10.48±1.43)%,椎体后凸角度改善(13.04°±2.03°);术后1d及1年VAS评分较术前分别改善(4.06±0.11)、(5.30±0.10),术后1年VAS评分较术后1d改善(1.34±0.08);术后1d及1年ODI评分较术前分别改善(36.08±2.13)%、(47.54±1.97)%,术后1年ODI评分较术后1d改善(11.26±0.54)%;术后邻近椎体再发骨折6例(12.0%)。两组发生渗漏患者均无明显临床不适。SPSS16.0统计软件分析两组骨水泥注入量、骨水泥渗漏率、术后1年邻近椎体再发骨折率差异有统计学意义(P<0.05),而VAS、ODI评分改善、椎体前缘高度压缩率改善、Cobb角改善情况差异无统计学意义(P>0.05)。结论椎体成形术不同手术入路治疗老年性骨质疏松椎体压缩性骨折均能获得良好的临床疗效,且双侧经皮椎弓根入路具有骨水泥渗漏发生率低、术后相邻椎体再骨折低的优点。     

辛伐他汀对骨质疏松大鼠的防治作用

目的 探讨他汀类药物对绝经后骨质疏松症的防治作用及其相关机制.方法 40只SD雌鼠随机分为4组:去势组(OVX组)、对照组(Sham组)及2个辛伐他汀(simvastatin, Simv)治疗组,每组10只.2个辛伐他汀治疗组分别为10、20mg/kg(S1和S2组),每天灌胃一次.观察术后12周骨形成指标:骨钙素(BGP)和骨特异碱性磷酸酶(骨AKP);骨吸收指标:尿呲啶醚(PYD)和脱氧呲啶醚(DPD).用形态计量学、骨生物力学等实验技术, 观察辛伐他汀的治疗效果.结果 经辛伐他汀治疗后,S1和S2组BGP和骨AKP明显高于单纯去势组(分别为P<0.05),同时尿PYD和DPD下降,且S2组与OVX组相比,有显著性差异(P<0.05).与OVX组相比,S1、S2组骨小梁间距(Tb·Sp)明显降低(P<0.05),骨小梁面积百分比(Tb·Ar)、骨小梁宽度(Tb·Th)、骨小梁数目(Tb·N)、骨生物力学均增加(P<0.05),且S1与S2组之间无显著性差异.与OVX组相比,S1、S2组股骨、腰椎BMD明显增加(P<0.05).结论 辛伐他汀在预防去势大鼠骨质疏松症的过程中,可能同时存在促进成骨和抑制破骨两方面的作用.     

经皮带球囊支架植入椎体成形术治疗老年骨质疏松性椎体压缩骨折的临床疗效

目的评价经皮带球囊支架系统植入椎体成形术(VBS)治疗老年骨质疏松性椎体压缩骨折的安全性和临床疗效。方法纳入老年性骨质疏松性椎体压缩骨折患者38例,根据住院号奇偶数随机分成两组,分别采用VBS治疗和传统经皮球囊扩张椎体后凸成形术(PKP)治疗。通过对患者手术前后疼痛情况和功能改善情况、椎体压缩等影像学变化、矢状面Cobb角度变化以及骨水泥渗漏情况等相关指标对比分析,评估VBS的安全性和临床有效性。结果手术均由同一术者完成,手术方式均采用局部麻醉下经皮双侧穿刺法,试验组和对照组所有病例均安全顺利完成。所有病例均经半年以上随访,术后3 d、术后1个月、3个月及半年随访VAS评分和ODI功能障碍指数,均较术前明显改善,差异有统计学意义(P<0.05)。术后3 d、术后1个月、术后3个月及半年随访,试验组和对照组骨折椎体高度较术前均有明显改善,差异有统计学意义(P<0.05)。Cobb角均较术前有明显改善,差异有统计学意义(P<0.05);试验组和对照组相应指标对比分析,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 VBS治疗老年骨质疏松性椎体压缩骨折,在骨折椎体高度的恢复、骨折疼痛的缓解方面均有显著疗效,且骨水泥渗漏等并发症发生率低,是一种治疗老年骨质疏松性椎体压缩骨折的有效方法。     

骨质疏松性骨折愈合过程中骨痂局部生物力学改变的实验研究

目的　探讨骨质疏松骨折动物模型愈合过程中骨痂局部生物力学性能的变化。方法　利用大鼠骨质疏松胫骨骨折模型 ,测量了骨痂局部弹性模量和极限强度的变化。结果　骨质疏松骨折愈合过程中 ,弹性模量和极限强度均随着骨折愈合过程的进行而增加 ,在骨折后 3 5d编织骨完全形成后 ,极限强度与非骨折组相比无明显差别 ,而弹性模量尚有明显差别 ;在同一时间点与正常骨折组相比均无明显差别。结论　骨质疏松骨折骨痂局部的弹性模量及极限强度的变化模式与正常骨折骨痂相比无明显差别。     

TGF-β_2对体外培养的牛眼小梁细胞MMP_2表达和活性的影响

目的了解转化生长因子-β2(TGF-β2)对体外培养的牛眼小梁(TM)细胞基质金属蛋白酶-2(MMP2)的表达和活性的影响,探讨TGF-β2在原发性开角型青光眼(POAG)发病机制中的作用。方法用含有1.0μg/L TGF-β2或含1.0μg/L TGF-β2+100g/L鼠抗人PAI-1IgG(PAI-1中和抗体)的无血清DMEM分别孵育TM细胞24、36、48h。对照组(Co)加入不含实验药物的无血清DMEM,用Western印迹法检测MMP2及纤溶酶原活化抑制剂-1(PAI-1)的表达。结果TGF-β2可显著增强TM细胞MMP2前体及PAI-1的表达。PAI-1中和抗体可促进MMP2前体向其活化形式转化。结论TGF-β2可通过抑制MMP2的活化过程导致TM细胞的细胞外基质(ECM)的异常堆积,造成房水引流阻力的增加,参与POAG的发病。     

白细胞介素-2对小鼠神经病理性痛的镇痛作用

目的探讨白细胞介素-2(IL-2)对神经病理性痛的镇痛作用及其可能的机制,为临床治疗神经病理性痛筛选新的镇痛药物奠定基础。方法通过结扎雄性C57BL/6小鼠单侧L5/L6脊神经建立神经病理性痛模型,然后利用机械刺激和冷刺激诱发的痛觉超敏实验分别观察腹腔注射不同剂量(1.0×106、2.5×106、5.0×106u/kg)IL-2对疼痛模型小鼠患侧脚掌痛阈的影响;同时,通过5.0×106u/kg IL-2注射前30 min腹腔注射纳洛酮(1 mg/kg)以观察阿片受体拮抗剂对IL-2镇痛作用的影响。结果腹腔注射IL-2可产生剂量依赖性镇痛作用,其中5.0×106u/kg和2.5×106u/kg IL-2均可显著提高模型小鼠患侧脚掌的50%缩足阈值(P<0.01)和降低5 min抬足次数(P<0.05),镇痛效应分别维持30 min和15 min,而1.0×106u/kg IL-2无明显的镇痛作用。IL-2产生的镇痛效应不能被纳洛酮阻断。结论IL-2对小鼠神经病理性痛具有镇痛作用,其镇痛效应除受阿片受体介导外还可能有其他分子参与。     

醛固酮及螺内酯对肝星状细胞中TIMP-1和MMP-2mRNA表达的影响

目的观察醛固酮及螺内酯对活化的肝星状细胞(HSC-T6)作用后不同时间段MMP-2和TI MP-1 mRNA的表达情况。方法采用RT-PCR的方法测定HSC-T6中MMP-2、TI MP-1 mRNA的表达。结果活化的HSC可表达MMP-2及TI MP-1的mRNA。醛固酮组MMP-2、TI MP-1的mRNA在48、72 h表达均高于对照组,在作用24、48、72 h时MMP-2、TI MP-1的mRNA的表达随时间递增。而螺内酯组则相反。醛固酮加螺内酯组与单加醛固酮组相比MMP-2、TI MP-1的mRNA表达下降。结论醛固酮可能通过促使MMP-2及TI MP-1 mRNA的表达促纤维化,螺内酯可抑制这一作用。