Gli-1在缺氧诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮-间质转分化中的重要作用

目的探讨Gli-1在缺氧诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮-间质转分化(EMT)及侵袭中的重要作用。方法通过缺氧培养乳腺癌MDA-MB-231细胞,以常氧培养作为对照。Transwell小室侵袭试验检测各组MDAMB-231细胞的侵袭能力;Western blot检测HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin蛋白的表达水平。通过shRNA稳定转染乳腺癌细胞,再次通过Transwell小室侵袭试验检测缺氧对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,Western blot检测HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin蛋白的表达水平。结果缺氧可明显诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭,并上调HIF-1α、Gli-1和vimentin蛋白,下调E-cadherin蛋白。靶向沉默Gli-1基因后,缺氧失去了对乳腺癌细胞侵袭和EMT的诱导作用。结论缺氧通过上调Gli-1表达活化Hedgehog通路,诱导乳腺癌细胞侵袭及EMT过程。     

NT4p53(C22)Ant融合基因重组腺病毒的构建及对肝癌细胞的杀伤作用

目的构建编码融合基因NT4p53(C22)Ant嵌合肽的重组腺病毒表达载体,并研究其对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用。方法使用分子克隆技术,通过同源重组获得重组腺病毒rAVV-NT4p53(C22)Ant,收集上清、大量扩增并测定其滴度。感染人肝癌HepG2细胞,采用免疫组化法检测p53表达,MTT实验、流式细胞仪观察rAAVNT4p53(C22)Ant对肿瘤细胞的杀伤作用。结果成功构建重组腺病毒表达载体,感染人肝癌HepG2细胞后p53表达率为(44.88±2.45)%;MTT检测显示,细胞存活率随作用时间延长明显降低,与空病毒组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),流式细胞仪检测显示G0/G1期细胞比例及凋亡细胞较空病毒组及对照组增加。结论构建的NT4p53(C22)Ant重组腺病毒在肝癌细胞中能有效表达,对肝癌HepG2细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。     

miR-338-3p在恶性肿瘤中的表达异常及其表观遗传组蛋白的修饰位点

目的探讨不同种类肿瘤中miR-338-3p表达谱及其表达异常的表观遗传修饰调控机制。方法生物信息学大数据库(TCGA Pan-Cancer)分析miR-338-3p在15种不同种类肿瘤组织中的表达谱;以胃癌为研究对象,分析数据库中45例正常胃组织和366例胃癌组织中miR-338-3p表达情况;CRCH37数据库预测miR-338-3p上游启动子区组蛋白修饰位点;利用染色质免疫共沉淀获取组蛋白结合的DNA,PCR扩增miR-338-3p启动子区片段,凝胶电泳验证PCR产物。结果 miR-338-3p在包括食道癌(ESCA)等不同种类肿瘤中表达异常,其中ESCA、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、肾嫌色细胞癌(KICH)、肾乳头状肾细胞癌(KIRP)、肺鳞癌(LUSC)和甲状腺癌(THCA)中表达显著下调(P<0.05),而在结肠腺癌(COAD)、肾透明细胞癌(KIRC)和肝细胞肝癌(LIHC)表达显著上调(P<0.05);366例胃癌组织中miR-338-3p表达普遍下调;染色质免疫共沉淀结合PCR证实组蛋白H3K9m2和H3K4m3是可能引起miR-338-3p下调的两个修饰位点。结论 miR-338-3p在胃癌中表达下调,组蛋白H3K9和H3K4甲基化修饰是潜在原因。     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定

目的检测本课题组已构建的缺氧诱导的hTERT基因启动子(5HRE-hTERTp)调控的基因表达载体调控元件的肿瘤特异性和对缺氧诱导的反应性。方法 MTT法检测不同浓度(100、200、300、400、500μmol/L)CoCl2对LoVo细胞活力以及增殖的影响。收集前期已包装成功的缺氧反应元件(hypoxia-response elements,HRE)和人端粒酶催化亚单位启动子hTERTp联合调控CDX2表达的慢病毒表达载体pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG(5HhC)病毒液,感染hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞,细胞免疫组化法验证该治疗载体的靶向性;复苏前期筛选的稳定表达5HhC的LoVo细胞(5HhC/LoVo),用缺氧模拟剂CoCl2模拟缺氧微环境,Western blot和RT-PCR分别检测缺氧调控下CDX2的表达水平。结果结肠癌细胞株LoVo在不同浓度CoCl2环境下随缺氧时间的延长,细胞活力及增殖均受到抑制,在高浓度(300、400、500μmol/L)作用下抑制效果更加明显;5HhC病毒成功感染hTERT+LoVo细胞,而在hTERT-HK-2细胞中不表达;Western blot和RT-PCR证实缺氧可上调5HhC/LoVo细胞中CDX2蛋白和mRNA的表达,且在300μmol/L CoCl2作用24h其蛋白表达量最高。结论缺氧微环境可明显上调hTERTp靶向性的治疗载体5HhC中抑癌基因CDX2的表达。     

Calphostin C对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及相关机制

目的 研究Calphostin C对乳腺癌细胞MDA-MB-435S增殖的影响及初步机制.方法 通过观察Calphostin C处理MDA-MB-435S细胞前后细胞的生长速度、倍增时间、克隆形成率和细胞周期分布等变化,探讨Calphostin C对MDA-MB-435S细胞增殖的影响;通过Western blotting、免疫细胞化学染色和RT-PCR等方法探讨Calphostin C影响MDA-MB-435S细胞增殖的初步机制.结果 与MDA-MB-435S亲本细胞(对照组)相比,Calphostin C处理的MDA-MB-435S细胞(实验组)生长速度明显减慢,倍增时间明显延长(P<0.01),并且呈现浓度和时间依赖性;对照组和实验组细胞克隆形成率分别为(82.33±6.81)%和(22.00±1.73)%,差异有统计学意义(P<0.01);实验组细胞周期出现明显的G1期阻滞(P<0.01).Western blotting和免疫细胞化学染色结果显示,与对照组细胞相比,实验组细胞中蛋白激酶Cα(protein kinase Cα, PKCα)表达没有明显变化,但活性状态(胞质转位至胞膜)的PKCα显著减少.Western blotting和RT-PCR结果显示,与对照组细胞相比,实验组细胞中p53、Cyclin A和Cyclin B表达没有明显变化,但p21表达上调,Cyclin E表达下调.结论 Calphostin C可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-435S的增殖,该作用可能与其抑制PKCα活性、上调p21表达和下调Cyclin E表达有关.     

MGBA抗原特异性CD8~+CTL细胞与CIK细胞杀瘤活性的对比研究

目的比较乳腺珠蛋白A(MGBA)抗原特异性CD8~+CTL细胞与CIK细胞对乳腺癌细胞的杀伤效果。方法从健康志愿者外周血中提纯单个核细胞,体外分离、诱导培养成树突状细胞(DC)、CTL和CIK细胞,用免疫磁珠法从CTL细胞中分选CD8~+CTL细胞;用表达乳腺珠蛋白的重组腺病毒(Ad-MGBA)转染DC细胞后,经刺激制备MGBA抗原特异性CD8~+CTL与CIK细胞,用流式细胞术检测两种杀伤细胞对乳腺癌细胞的杀伤效果。结果 CD8~+CTL和CIK对表达MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-415细胞杀伤率分别是63.07%和48.35%(P<0.05);对不表达MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤率是14.62%和29.29%(P<0.05)。结论抗原特异性CD8~+CTL对表达该抗原的乳腺癌杀伤效果高于CIK细胞,而对不表达该抗原的乳腺癌细胞的杀伤效果低于CIK细胞。     

含hITF基因cDNA的腺病毒载体的构建及其感染肠上皮细胞的研究

目的构建含有人肠三叶因子基因cDNA的腺病毒载体,并观察其对肠上皮细胞的感染能力。方法利用PCR技术扩增hITF基因cDNA全长序列,测序后亚克隆至腺病毒穿梭质粒,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1大肠杆菌株BJ5183感受态细胞中进行同源重组,内切酶PmeⅠ线性化后转染HEK293细胞进行病毒包装及扩增,并进行滴度测定。将重组腺病毒感染肠上皮细胞(HT-29),荧光显微镜观察感染效果。结果成功构建出重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hITF,PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,PacⅠ酶切鉴定后命名为Ad-hITF;重组腺病毒载体在HEK293细胞中包装,获得重组腺病毒颗粒;根据Karbers公式计算病毒颗粒滴度为2×109 pfu/mL;重组腺病毒可以感染肠上皮细胞(HT-29),感染效率较高。结论成功构建含hITF基因cDNA的重组腺病毒载体并获得大量子代重组腺病毒,为腺病毒介导hITF基因治疗的应用打下基础。     

Hedgehog信号通路通过上皮细胞间质转分化调控乳腺癌细胞侵袭

目的研究Hedgehog信号通路对乳腺癌细胞侵袭能力的影响及其可能机制。方法通过Western blot和Real-time RT-PCR,检测人乳腺癌细胞MDA-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A中SHH、SMO和Gli-1蛋白和mRNA表达。通过小干扰RNA转染MDA-231,以未转染细胞为正常对照组,转染siRNA Control为阴性对照组,Western blot和RT-PCR法检测靶向沉默SMO基因的效果,Transwell小室侵袭试验检测各组MDA-231细胞的侵袭能力,Western blot检测Gli-1、Snail、MMP-9、E-cadherin和Vimentin的表达变化。结果人乳腺癌细胞MDA-231高表达SHH、SMO和Gli-1。通过RNA干扰技术靶向沉默MDA-231细胞SMO基因,其细胞侵袭能力显著下调,其Gli-1、Snail、MMP-9、Vimentin表达下调,E-cadherin表达增强。结论 Hedgehog通路的异常激活与乳腺癌细胞侵袭相关,其机制可能与诱导乳腺癌上皮细胞间质转分化有关。