新型抗ErbB2、抗CD16三价双特异性抗体的构建及功能鉴定

目的构建一种新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb。方法构建重组载体pET22b( )/BsAb;转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组蛋白的表达,通过包涵体复性纯化蛋白。应用悬浮培养系统扩增稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(CG5细胞)和稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(HG2细胞),通过rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化融合蛋白,应用流式细胞术分析BsAb的结合能力。结果该BsAb可在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达,通过对重组蛋白的复性可获得高纯度的蛋白;复性后的BsAb具有与其亲本抗体相似性的结合靶抗原的能力。结论新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb能与高表达ErbB2的乳腺癌细胞系SKBR3细胞高亲和力结合和表达CD16的人外周血单个核细胞低亲和力结合。     

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的　扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法　从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果　VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论　构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。     

抗人γ-精浆蛋白VH单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的扩增出抗人γ-精浆蛋白(γ-Sm)单克隆抗体(mAb)的重链可变区(VH)单域抗体基因,并进行原核表达及空间构象分析。方法从分泌抗γ-SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经RT-PCR扩增VH单域抗体基因,将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果VH单域抗体基因全长363bp,含起始码和终止码。将其克隆到pGEX-4t-1内,转化大肠杆菌DH5α,获得高效表达,表达量占全菌总蛋白质的38％,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后,用谷胱甘肽(GST)亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗γ-SmVH单域抗体。竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论构建成功抗γ-Sm的VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

蛋白印迹法与免疫荧光法检测白血病患者Survivin表达

目的　比较蛋白印迹法和免疫荧光法检测Survivin表达结果,以探寻临床上切实可行的检测方法。方法　应用蛋白印迹(Western blots)和免疫荧光法检测18例白血病患者和10例正常对照组外周血中单个核细胞Survivin的表达。结果　Western blots 法检测Survivin 表达阳性13 例(72. 2%);免疫荧光法检测Survivin 表达阳性11 例(61.1%)。两种方法检测10例正常对照组外周血单个核细胞中Survivin的表达均为阴性。两种检测方法的符合率为88.89%。结论　Survivin是否表达可能成为白血病临床诊断、预后判断的有效指标。两种检测方法具有良好的一致性,免疫荧光法操作比较简单,适于在临床上应用。     

大鼠不同分离纯化方法对胰岛细胞丢失的影响

目的探讨提高大鼠胰岛细胞产量和纯度的最佳分离纯化方法。方法40只大鼠分为4组,每组10只。A组:Hanks液灌注 胶原酶V消化 Ficoll400梯度纯化;B组:组织剪碎研磨 筛网过滤;C组:胶原酶V灌注 Ficoll400梯度纯化;D组:胶原酶V灌注 筛网过滤。对用四种不同方法分离纯化的结果进行比较。结果完全随机设计的方差分析显示,A、B、C、D组收获量及纯度比较均有显著性差异(P<0.05);组间多重比较显示,A组收获量均高于B、D组(P<0.05),与C组比较差异无统计学意义(P>0.05);A组纯度与其他组比较均无显著性差异(P>0.05)。结论用胶原酶V或Hanks液灌注,Ficoll400梯度纯化法所收获胰岛细胞的产量和纯度较高,而且价格低廉,是一种较理想的胰岛细胞分离纯化方法。     

抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法　在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论　获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础     

姜黄素联合顺铂对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖的抑制作用

目的 探讨姜黄素及其联合顺铂对体外培养人卵巢癌SKOV-3细胞增殖的抑制作用.方法 将SKOV-3细胞培养并分别单独加入不同浓度姜黄素(5、10、20、40、80 μ mol/L)、顺铂(10 μmol/L)及联合作用后,用MTT法检测SKOV3细胞增殖情况.流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布.结果 MTT法检测结果显示,不同浓度姜黄素组,随着药物浓度增加,作用时间延长,细胞的增殖抑制率上升(P＜0.05);联合用药组明显高于单一用药组(P＜0.05).流式细胞术结果显示,姜黄素能使卵巢癌SKOV-3细胞发生G2/M期阻滞,诱导细胞凋亡;随着姜黄素用药浓度增加,细胞凋亡率增高.结论 姜黄素对卵巢癌SKOV-3细胞增殖具有抑制作用,在一定范围内,这种抑制作用呈剂量-时间依赖性;姜黄素、顺铂联合应用具有协同作用.     

新型EGFP标记的杆状病毒转移载体的构建及EGFP的制备

目的构建可表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体,利用Sf-9细胞表达、制备EGFP。方法用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因,NcoⅠ/SalⅠ双酶切,克隆入杆状病毒转移载体NcoⅠ/SalⅠ酶切位点之间,获得pFB-EGFP质粒;转化E.coliDH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Ac-EGFP;感染Sf-9昆虫细胞;利用激光共聚焦显微镜和SDS-PAGE观察并检测EGFP的表达。非变性法纯化EGFP。结果荧光显微镜和激光共聚焦显微镜证实感染的Sf-9细胞可表达EGFP;通过SDS-PAGE获得的EGFP,大小为27ku。结论重组pFB-EGFP载体具备表达EGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达EGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。     

亲和色谱技术在药物分析中的应用进展

亲和色谱是依靠键合在固定相上的配位体与生物活性目标分子间特异性的识别与可逆的亲和作用,实现生物分子选择性分离的一种液相色谱分析方法。该方法具有高选择性、高回收率等特点,可同时进行色谱分离及活性筛选,广泛应用于活性产物的筛选、分离和纯化。本文简述了生物特效亲和色谱、印迹分子亲和色谱、染料配基亲和色谱等几种常用亲和色谱技术,综述了近年来亲和色谱在手性药物拆分、天然药物中活性组分筛选、活性蛋白分离纯化及药物-蛋白相互作用研究中的应用,并对其应用前景进行了展望。     

不含氨基末端的PIF1解螺旋酶的纯化和初步功能研究

目的 从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,纯化只含有解螺旋酶模序,不含N-末端的PIF1蛋白--PIF1△N,并对其生物化学活性进行检测.方法 以Hela细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1的540～1 923的cDNA序列,在cDNA的5′端引入六聚组氨酸标签后插入pET20b表达载体,得到重组质粒pET20-PIF1△N.通过共转化此重组质粒和一个编码稀有rRNA的质粒,PIF1△N蛋白在大肠杆菌中得到表达.在4 ℃通过一系列亲和层析柱,用高效液相纯化系统纯化了PIF1△N蛋白,并检测其生物化学活性.结果 从Hela 细胞的cDNA文库中克隆了PIF1蛋白的540～1 923的基因片段,使其在大肠杆菌中成功表达.建立了纯化PIF1△N蛋白的亲和层析方法, 并检测了其ATP酶活性.结论 不含N-末端的PIF1蛋白-PIF1△N,具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

结核杆菌DnaA蛋白的原核表达及免疫血清的制备和检测

目的 在大肠杆菌中表达重组结核杆菌DnaA蛋白,对表达产物进行纯化、鉴定后制备DnaA蛋白特异性免疫血清并进行Western blot检测.方法 以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组为模板,PCR扩增DnaA基因,构建DnaA原核表达质粒pET-DnaA,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表...     

Preparation of recombinant firefly luciferase by a simple and rapid expression and purification method and its application in bacterial detection

A simple and rapid expression and purification method of recombinant firefly luciferase was developed for bacteria detection. A modified luciferase gene from North American firefly Photinus pyralis was cloned into pET28a expression vector and the recombinant protein was produced in Escherichia coli BL21. The recombinant luciferase, equipped with a polyhistidine affinity tag, was purified by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). The approach generated an abundant expression and an efficient purification of a recombinant luciferase with final yield 1.995mg/L of cell culture. Experiments on the recombinant luciferase also showed that the relative light units (RUL) of the enzyme were 5.8×108, and the specific activity was 2.9×1010 RLU/mg. By applying adenosine triphosphate (ATP) bioluminescence to detection of the coin bacteria using the recombinant protein, the ATP content of bacteria was 9.48×10-16mol/mL, and was identical to the bacteria counts (4500CFU/mL) in order of magnitude. Taken together, our results provided a simple and efficacious method of the preparation of recombinant luciferase, which could be applied in the determination of bacteria via ATP bioluminescence.     

CLONING SEGMENT SPIKE PROTEIN GENE OF SARS-COV AND ITSEXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI

Objective Expressing and purifying the seglnent of SARS-CoV spike protein in E. Coli Methods The target gene was obtained by RT-PCR. The PCR product was cloned into pEGM- T Easy Vector, sequencing and double restriction digestion (BamH Ⅰ , Pst Ⅰ) were performed. The target gene was subcloned into PQE30 expression vector. The gene was expressed in the E. coli strain M15 cells induced by IPTG. The protein was purified with a nickel HiTrap chelating metal affinity column. Results The recombinant expression plasmid was successfully constructed and the protein was well expressed in E. coli strain M15 cells. The ideal pure protein was obtained by purification. Western blotting analysis suggested the protein could act with the convalescent sera of lab confirmed SARS patients. Conclusion The segment of SARS-CoV spike protein was well expressed and purified, and can be applied in diagnosis and immunological research of SARS.     

迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定

目的 构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因.方法 采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)中克隆出V_H和V_L可变区基因, 再通过重叠延伸拼接PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly_4ser)_3,体外构建单链抗体基因;将其克隆至表达载体pET-28a并在大肠杆菌中表达,表达产物纯化后,用SDS- PAGE、Western blot及ELASA进行鉴定.结果 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、纯化和体外复性,获得了高纯度的单链抗体片段,重组蛋白的分子质量为27 ku.ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力.结论 成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv,为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础.     

亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学分析

目的 对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1,EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究.方法 将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a( )中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果 均表明重组质粒pET-28a( )-EF-1构建成功.重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.     

人颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡

目的　观察诱导表达的颗粒酶B融合蛋白对HeLa细胞形态和生长的作用。方法　用重组PCR法将活性型颗粒酶B基因序列的 5’端连接绿脓杆菌外毒素 (PE)的部分转位肽编码序列。所获融合蛋白基因克隆入pIND诱导表达载体后 ,与辅助质粒pVgRXR共转染HeLa细胞 ,经G4 18和zeocin筛选建系。间接免疫荧光检测蜕皮激素诱导后目的蛋白的表达 ,并通过电镜、TUNEL染色、细胞计数等方法观察细胞的形态和生长速度的变化。结果　建立了可诱导表达人颗粒酶B融合蛋白基因的HeLa细胞系。蜕皮激素诱导后检测到目的蛋白的表达 ,同时观察到细胞出现多核巨细胞的异常形态 ,细胞生长受到抑制。电镜和TUNEL分析表明 ,颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达使部分细胞呈现凋亡的典型特征。结论　颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡     

Expression and Application of the Recombinant Non-Structural Proteins of FMDV

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is acausative agent of highly infectious and economi-cally important disease in cloven-hoofed animals.In Asian and South American countries, commer-cial vaccines of FMDV are widely used for control-ling the disease, but animals in North America andEurope are not inoculated with FMD vaccines.Identifying animals that have been infected withFMDV is important because infected cattle andsheep can become carriers of the virus[1,2]Althoughonly African buff…     

IN VITRO CO-STIMULATORY ACTIVITY OF HUMAN B7.2(IgV+C)PROTEIN PRODUCED BY ENGINEERED BACTERIA

It was well known that "two signals" wereboth necessary to activate T lymphocytes. The firstsignal was provided by TCR--CD, which was en-gaged with antigen peptide--MHC complex, and thesecond, also named the costimulatory signal, wasprovided by the interaction between costimulatorymolecules B7. l and B7. 2 on antigen presenting celland its counter--receptor CD28/CTLA4 on T cell.The first signal alone without costimulation willlead T cell to anergy or apoptosis['~'2. B7. 2 mayplay a cri…