人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建

目的通过生物技术获得促甲状腺激素受体膜外区表达载体,为TSHR膜外区的研究提供有力工具。方法从人甲状腺组织中提取总RNA,RT-PCR分离得到TSHR膜外区cDNA,双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。结果经酶切鉴定、测序分析表明TSHR膜外区片段与GenBank提供的完全相同。结论成功构建了人TSHR膜外区真核表达载体。     

HBV preS1基因酵母表达载体的构建及表达

目的 构建HBV preS1基因的酵母表达载体,探讨HBV preS1蛋白的功能.方法 以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增HBV preS1基因,克隆到pGEM-T载体中命名为T-preS1,以NcoⅠ和MluⅠ双酶切T-preS1后回收与酵母表达载体pSos连接,对重组质粒进行序列测定后命名为pSos-preS1,经醋酸锂法将其转化酵母菌cdc25(a),提取酵母蛋白质进行Western免疫印迹分析.结果 成功构建了HBV preS1基因的酵母表达载体,Western免疫印迹分析显示HBV preS1基因在酵母细胞中正确表达.结论 pSos-preS1的构建为通过SOS招募系统(sos-recruitment system, SRS)筛选与HBV preS1蛋白相互作用的蛋白和进一步探讨HBV preS1蛋白在HBV致病中的作用奠定了基础.     

热诱导HeLa细胞中HSP70蛋白的动态变化

目的 研究不同温度热诱导后ＨｅＬａ细胞热休克蛋白蛋白动态表达。方法 ＨｅＬａ细胞经过不同温热的诱导以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法检测细胞裂训ＨＳＰ７０蛋白表达。结果 热诱导后ＨＳＰ７０蛋白表达的高峰出现时间随诱导温度的提高逐渐后移,且４１℃,４２℃热诱导后蛋白表达于诱导后８－１６ｈ期间有持续高水平表达,而４５℃,３０ｍｉｎ热诱导细胞大部分于诱导后即时死亡,且仅有低水平的ＨＳＰ７０表达;     

野生型p27和核定位信号缺失型p27真核表达载体的构建及表达

目的 构建人野生型p27(p27WT)和核定位信号缺失型p27(p27△NLS)的真核表达载体,并在HEK293T细胞中进行表达,为细胞中p27核浆定位的变化及其不同的生物学功能研究提供细胞基础。方法 提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA,反转录cDNA后,分别进行p27全长和非NLS区片段的PCR扩增,获得p27WT全长(CDKN1B,NM＿004064.5)和p27△NLS编码区序列,分别将其克隆至真核表达载体pCMV-Blank,经菌液PCR、双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染HEK293T细胞,48 h时分别提取胞核蛋白和胞质蛋白,Western blotting检测p27在细胞质和细胞核中的蛋白表达。结果测序结果显示,真核表达载体pCMV-Blank中插入的p27WT序列和p27△NLS序列均与NM＿004064.5序列相一致。pCMV-p27WT转染HEK293T细胞后,细胞总p27蛋白表达显著增加,核浆分离检测发现其在细胞质和细胞核中均表达;而pCMV-p27△NLS转染HEK293T细胞的总p27蛋白表达也显著增加,核浆分离检测发现其主要在细胞质中表达。结论 成功构建人p27...     

先天性长QT综合征相关人类HERG基因真核表达载体的构建及其功能表达

目的构建先天性长QT综合征相关HERG基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,建立稳定的细胞系,探讨基因的功能。方法原核克隆载体pGEM-HERG经限制性内切酶获得HERG cDNA,将HERG cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3中,用Lipofectamin2000转染试剂介导将pcDNA3-HERG及荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染至HEK-293细胞,利用G-418进行细胞筛选,并用稀释法建立稳定的HEK-HERG细胞系。用全细胞膜片钳技术检测HERG基因的功能表达情况。结果在原核克隆载体pGEM-HERG的基础上构建了HERG的真核表达载体pcDNA3-HERG,并使其在HEK-293细胞中成功表达,建立的HEK-HERG细胞系稳定传代。膜片钳技术检测到了HERG通道电流的表达。结论该方法可成功构建及表达HERG的真核表达载体,为今后突变型HERG的研究奠定了基础。     

人B7.2 cDNA的克隆及其真核表达

为克隆人 B7.2 c DNA,构建 B7.2真核表达质粒 ,并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞 ,经 LPS诱导后 ,以 RT- PCR,克隆 B7.2 c DNA;构建真核表达质粒 p BCMGSNeo- B7.2 ,转染哺乳细胞 ,进行表达。结果成功克隆了 B7.2c DNA,并经测序证实 :所构建的 B7.2抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经 LPS诱导的人淋巴细胞可表达 B7.2 m RNA,所建立的 p BCMGSNeo-B7.2哺乳动物真核表达质粒 ,可供进一步研究 B7.2结构和功能。     

热休克蛋白70反义寡核苷酸联合化疗药物抑制肝癌细胞HepG2增殖的实验研究

目的研究热休克蛋白70反义寡核苷酸(HSP70ASODN)联合化疗药物对肝癌细胞的增殖抑制作用。方法采用MTT法比较转染组和未转染组联合化疗药物在肝癌细胞增殖方面的差异。结果检测HepG2细胞株对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性,24、48、72、96h未转染组与转染组的细胞生长抑制率分别为:0.323±0.043、0.468±0.015,0.394±0.045、0.663±0.026,0.526±0.021、0.793±0.041,0.616±0.016、0.899±0.044(P均<0.05)。检测HepG2细胞株对化疗药物ADM的敏感性,24、48、72、96h未转染组与转染组的细胞生长抑制率分别为:0.157±0.021、0.421±0.037,0.394±0.045、0.574±0.037,0.293±0.036、0.637±0.019,0.302±0.023、0.658±0.038(P均<0.05)。结论 HSP70ASODN能增强化疗药物对HepG2的增殖抑制作用;HSP70ASODN联合多药化疗优于联合单药化疗。     

人PIF1及其截短体重组蛋白的真核表达及其细胞内定位

目的构建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT结构域(PIF1N)截短体真核表达重组质粒,进行真核表达,并确定PIF1、PIF1C、PIF1N在细胞内定位。方法以HeLa cDNA为模板PCR获取PIF1、PIF1C、PIF1N编码区cDNA,将其插入pCMV-Tag 2B质粒中构建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒;通过lipofectamine2000将重组质粒转染人293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达,用免疫荧光法检测其细胞内定位。结果成功构建了PIF1及其截短体真核表达重组体,并在真核细胞内成功表达。确定PIF1定位于核内,PIF1C定位于整个细胞,呈弥散分布,PIF1N主要定位于核内。结论在真核细胞中成功表达了PIF1、PIF1C、PIF1N,且发现PIF1N对PIF1的入核起重要作用,为进一步研究其PIF1及其各结构域奠定了实验基础。     

pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。     

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。     

Anti-CD3 scFv-B7.1真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的初步表达

目的　构建anti CD3scFv B7.1真核表达载体 ,并进行初步表达。方法　采用重叠延伸拼接法 (splicingbyoverlapextention ,SOE)将anti CD3scFv和B7.1(V +C)两个基因片段通过spacer序列连接 ,将融合基因克隆入T载体 ,并测序证实。在此基础上构建真核表达载体pcDNA/anti CD3scFv B7.1,并经脂质体法转染COS 7细胞 ,免疫组织化学法检测表达。结果　获得了序列与预期完全相同的融合基因 ;构建了抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ;在COS 7细胞中获得初步表达。结论　成功构建及表达抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ,为进一步研究抗CD3scFv B7.1双功能分子的生物学活性及用于肿瘤生物治疗奠定了基础     

人U_6启动子表达载体的构建及在胃癌细胞中的活性鉴定

目的构建人U6(hU6)snRNA启动子驱动的小RNA分子的表达载体,并在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞中鉴定其表达外源性小RNA分子的活性。方法以人基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hU6snRNA启动子序列,并将其克隆入PUC19载体中,命名为PUC-hU6-extra,经测序证明其序列的正确性;用脂质体法转染SGC-7901细胞;用RT-PCR检测U6启动子的转录活性,并测定培养细胞的生长曲线。结果hU6snRNA基因启动子和紧接转录起始点hU6snRNA的前27个核苷酸被成功地克隆入PUC19质粒载体,重组载体在SGC-7901细胞中能高表达小分子RNA,并且未观察到后者对细胞体外增殖的影响。结论成功构建了以hU6snRNA启动子驱动的、能在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞内高效转录小分子RNA的表达质粒PUC-hU6-extra。     

牙龈卟啉菌蛋白酶rgp Acd基因表达载体的构建

目的构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd,插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b/rgpAcd,通过限制性酶切鉴定。结果PCR产物电泳结果显示,在大约1.5 kb处有一特异的条带,与预期的大小一致,核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性,未发生任何突变;构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致,表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功。结论成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法用PCR扩增BACE特异性小干扰RNA,转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒,再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中,通过限制性酶切对该重组表达载体进行鉴定。结果成功构建了BACE真核表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE。结论pLXSN/EGFP-U6-siBACE载体的成功构建对进一步利用基因干扰技术治疗阿尔茨海默病的研究奠定了重要的基础。     

Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建Apoptin的原核表达载体,并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法在获得Apoptin融合基因的基础上,成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a( )-Apoptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a( )-Apoptin的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与Apoptin融合蛋白一致。结论Apoptin原核表达载体pET-28a( )-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白,为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。     

槲皮素对SGC-7901胃癌细胞生长及HSP70和EGFR表达的影响

目的观察槲皮素对胃癌细胞SGC-7901生长及HSP70和EGFR的影响。方法以台盼蓝拒染法计数胃癌细胞的生长抑制率,透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫组化检测HSP70和EGFR的表达。结果台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制SGC-7901细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48 h后的IC50为14.12μmol/L。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经10-20μmol/L的槲皮素处理,SGC-7901细胞周期阻滞于G0/G1期,经10μmol/L槲皮素处理的SGC-7901下调HSP70和EGFR蛋白的表达。结论槲皮素能抑制胃癌细胞的生长,呈时间剂量依赖性,能诱导SGC-7901发生凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调HSP70和EGFR的表达有关。     

Construction of expression vector for NT4-ADNF-9 fusion gene

Objective To construct the prokaryotic expression vector bearing fusion gene NT4-ADNF-9 and lay foundation for further study on genetic therapy of neuraseusory deafness. Methods By means of asymmetrical prince/ template, double stranded eDNA of activity dependent neurotrophic factor-9 (ADNF-9) was obtained, which included restriction enzymes sites on the two extremities. ADNF-9 eDNA was ligated to the signal and leader peptides of nenrotrophin 4 (NT4), and the fusion gene was named NT4-ADNF-9. Then it was suheluned into prokaryotic expression vector pBV220, and called pBV220/ NT4-ADNF-9. Results Evidences of DNA sequence analysis and restrtction enzymes digestion showed that we recombined ADNF-9 eDNA to the 3'terminal of the signal and leader peptides of NT4, and the fusion gene was subcluned into pBV220 successfully. Bioactivity of the products was proved that it could support the cell survival and neurite growth in the primary cultures of dorsal root ganglia (DRG) of embryonic day-8 cbicken neurons as compared to the control. Conclusion Prokaryotic expression vector pBV220/NT4-ADNF-9 can be constructed successfully and the bioactivtty is satisfactory.