甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞HL-7702凋亡及其机制的研究

目的 观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate, GCDC)对人正常肝细胞株HL-7702凋亡的影响,并探讨其凋亡机制.方法 终浓度分别为100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h,光学显微镜观察GCDC对HL-7702细胞形态的影响,AnnexinV-FITC/PI双染色法检测HL-7702细胞的凋亡率 ,用荧光指示剂Fluo-3/AM测定HL-7702细胞内钙离子浓度,RT-PCR测定Bcl-2、Bax基因mRNA表达水平.结果 终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h后,细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变;100、150、200、250μmol/L的GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡,呈剂量依赖性,凋亡率分别为(13.16±2.9)% (t=6.41)、(20.3±3.0)% (t=10.22)、(25.02±2.1)% (t=18.11)、(45.02±3.5)% (t=28.89),较对照组(2.2±0.6)%显著升高(P＜0.05);GCDC能使HL-7702细胞内钙离子浓度增加,且具有浓度依赖性;GCDC使细胞内Bcl-2 mRNA的表达下降、Bax mRNA的表达增加.结论 GCDC可能是通过增加HL-7702细胞内钙离子浓度,并进一步下调Bcl-2、上调Bax表达水平,从而诱导细胞凋亡.     

HEK293细胞中杂合状态下无义突变体L539fs/47对野生型HERG电流的作用

目的研究单独表达无功能的无义突变体L539fs/47在HEK293细胞中杂合状态下对野生型HERG电流的作用。方法用脂质体转染法将野生型HERG及突变体HERG-L539fs/47分别转染HEK293细胞36h后,RT-PCR检测HERG mRNA表达,免疫荧光及免疫印迹检测HERG蛋白定位及表达量,全细胞膜片钳检测IHERG电流密度。结果野生组HERG的mRNA表达量高于L539fs/47突变组(1.066±0.612 vs.0.254±0.397,P<0.01)。免疫荧光检测发现野生型HERG蛋白多于突变体,野生型HERG蛋白主要分布在细胞膜上;而HERG突变体蛋白大部分滞留胞质。免疫印迹显示:不同于野生型HERG135ku及155ku 2个条带,突变体仅60ku 1个条带。全细胞膜片钳检测WT+MT组IHERG较WT组下降55.23%(22.03±2.62 vs.49.20±2.31pApF,P<0.01)。结论 HEK293细胞中杂合状态下截断突变体L539fs/47对野生型HERG电流的不完全负显性抑制作用。     

心脏传导阻滞SCN5A基因L1001Q突变体构建和功能研究

目的对作者发现的一个中国3代人心脏传导阻滞家系SCN5A基因新突变L1001Q,构建突变表达载体,利用分子生物学方法和全细胞膜片钳技术观察L1001Q突变的功能。方法一步定点诱变法构建pEGFP-L1001Q-SCN5A突变体;激光共聚焦和Western blotting技术检测突变蛋白定位和表达;全细胞膜片钳技术观察突变体钠电流。结果野生型和L1001Q突变均表达在细胞膜上,且表达量无明显变化。二者最大激活电流分别为(148.34±0.77)pA/pF和(132.59±0.96)pA/pF(P>0.05),L1001Q突变半失活电压V1/2为(-73.25±0.87)mV,较野生型正向转移约3.5mV[V1/2为(-76.71±0.73)mV,P<0.05],L1001Q突变失活后恢复时间常数较野生型稍减小,差异无统计学意义(WT tau=16.8ms,L1001Qtau=14.1ms,P>0.05)。结论 L1001Q突变未影响钠通道蛋白的表达和转运,主要通过改变钠通道门控特性引起钠通道功能减弱进而导致心脏传导阻滞。     

Cav1.3 L-型钙通道K228E突变体的构建及功能研究

目的 通过构建Cav1.3基因K228E突变,观察K228E突变对L-型钙通道电生理特性及蛋白表达和转运的影响.确定钙通道α1亚基结构域ⅠS4段上N-端带正电荷的氨基酸对该通道电生理学特性的作用,从而为创建钙通道起搏器奠定基础.方法 ①一步法快速定点诱变构建Cav1.3基因K228E突变体的真核表达载体;②膜片钳观察突变钙通道电流,激光共聚焦技术观察突变钙通道蛋白在细胞内的表达和定位.结果 ①检测表达于HEK293细胞上的L-型钙电流:转染野生型Cav1.3质粒和相关亚基质粒,可检出L-型钙电流,其半激活电压V1/2=(-36.56±2.08)mV、半失活电压V1/2 =(-42.93±0.14)mV(5mmol Ba2+);而转染K228E-Cav1.3质粒和相关亚基质粒的HEK293T细胞上未检测到钙电流;②检测K228E突变通道蛋白在细胞内的表达和定位:转染野生型和突变型Cav1.3质粒及相关亚基质粒,48h后观察到野生型与突变型钙通道蛋白在细胞膜上都有表达.结论 Cav1.3基因K228E突变虽不影响L-型钙通道蛋白质的表达与转运,但却不表达钙通道电流,是一种功能丧失性突变.     

Ghrelin对糖尿病大鼠心肌动作电位和瞬时外向钾电流的影响

目的探讨外源性ghrelin对糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌动作电位及瞬时外向钾电流(Ito)的影响。方法雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素(60mg/kg)诱导Ⅰ型DCM模型,并采用全细胞膜片钳技术观察ghrelin对糖尿病大鼠心室肌细胞动作电位及瞬时外向钾电流的影响。结果与DCM组比较,10~(-7) mmol/L ghrelin明显延长DCM大鼠心室肌细胞5%动作电位时程(APD50)[(12.49±2.32)%;n=7,P=0.037]及APD90[(26.29±5.13)%;n=7,P=0.006];并明显抑制Ito电流峰值,抑制率[(23.14±3.07)%;n=9,P=0.021]。结论外源性ghrelin抑制Ito电流而延长DCM大鼠心肌动作电位时程,参与糖尿病大鼠心脏电生理的重构。     

Src激酶抑制剂PP2对人舌鳞癌Tca8113细胞侵袭和转移的抑制作用

目的探讨Src激酶抑制剂PP2对人舌鳞癌Tca8113细胞侵袭、迁移能力的抑制作用。方法采用5、10、20μmol/L Src激酶抑制剂PP2处理Tca8113细胞24 h,分别使用Transwell小室和划痕法,测定PP2对Tca8113细胞侵袭和迁移能力的影响。结果处理24 h后,5、10、20μmol/L Src激酶抑制剂PP2处理组的p-Src表达均较未加药组明显下降(P均<0.05);未加药组及5、10、20μmol/L PP2处理组的穿膜侵袭细胞数分别为(232.76±28.65)个、(186.53±21.34)个、(129.18±17.96)个、(37.82±12.41)个,迁移细胞数分别为(259.38±25.27)个、(193.45±20.18)个、(143.24±18.04)个、(32.94±14.39)个,细胞迁移率分别为(11.51±0.84)%、(8.06±0.51)%、(5.13±0.57)%、(2.18±0.12)%,整体差异均有统计学意义(F=73.852、85.687、48.157,P均=0.000),且与PP2剂量呈负相关。结论 Src激酶抑制剂PP2能够有效抑制人舌鳞癌细胞Tca8113侵袭和迁移能力,并且效果呈浓度依赖性,可能对治疗人舌鳞癌具有一定的临床价值。     

高同型半胱氨酸血症对急性ST段抬高型心肌梗死患者淋巴细胞KV1.3-CaN-NFAT信号通路的影响

目的观察不同水平高同型半胱氨酸血症(Hhcy)对急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者淋巴细胞内电压门控性钾离子通道(KV1.3通道)-钙调神经磷酸酶(CaN)-活化T细胞核因子(NFAT)-炎性因子(IL-6、TNF-α)mRNA及蛋白表达水平的影响。方法入选STEMI患者90例,根据血浆Hcy水平分为3组:实验A组(STEMI组,Hcy<15μmol/L,n=30)、实验B组(STEMI+轻度Hhcy组,Hcy 15~30μmol/L,n=30)、实验C组(STEMI+中度Hhcy组,Hcy>30μmol/L,n=30),另选取健康体检者30例为对照组。抽取血标本后使用全自动生化仪测定血浆Hcy浓度,密度梯度离心法提取淋巴细胞,RT-PCR检测KV1.3、CnAα、NFAT1、IL-6、TNF-αmRNA的表达,Western blot检测KV1.3、CnAα、NFAT1蛋白的表达。结果各实验组较对照组KV1.3、CnAα和NFAT1的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01),各实验组间两两比较显示,实验B组较实验A组表达水平升高(P<0.05或P<0.01),实验C组较实验B组和实验A组表达水平升高(P<0.05或P<0.01)。各实验组IL-6和TNF-α的mRNA表达水平高于对照组(P<0.01),各实验组间两两比较显示,实验B组较实验A组表达水平升高(P<0.01),实验C组较实验B组和实验A组表达水平升高(P<0.01)。实验组血浆Hcy水平与KV1.3mRNA和蛋白表达之间呈正相关,相关系数分别为r=0.503(P=0.000)、r=0.726(P=0.000)。结论血浆Hcy浓度水平越高,STEMI患者淋巴细胞内KV1.3-CnAα-NFAT1的mRNA和蛋白表达水平及炎性因子IL-6、TNF-α的mRNA表达水平越高,这一信号通路可能是Hcy加重STEMI炎症反应的机制之一。     

稳心颗粒对家兔3层心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响

目的研究步长稳心颗粒对家兔左心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的影响,探讨稳心颗粒抗心律失常的作用机制。方法应用全细胞膜片钳技术,分别记录稳心颗粒组和对照组家兔内层(Endo)、中层(M)和外层(Epi)心室肌细胞的Ito,观察稳心颗粒对家兔心室肌细胞Ito的影响。结果在测试电压+50 mV时,对照组Epi、M和Endo细胞的Ito分别为(4 235.7±953.2)pA(n=11)、(4 115.8±743.1)pA(n=11)和(2 730.2±524.6)pA(n=11),Endo细胞的Ito电流强度明显小于Epi和M细胞(P<0.01);稳心颗粒灌胃给药后家兔左心室肌Epi、M和Endo细胞的Ito电流强度分别为(4 806.4±1 381.8)pA(n=11)、(4 661.3±902.6)pA(n=11)和(4 072.9±1 234.9)pA(n=11),与对照组相比稳心颗粒可明显增加Endo细胞Ito的电流强度(P<0.01)。结论稳心颗粒增加Endo心室肌细胞Ito的电流强度,使心室的跨壁复极离散度(TDR)减小,这可能是其抗心律失常的重要机制之一。     

姜黄素对内毒素诱导的血管平滑肌细胞Toll样受体4/NADPH氧化酶/活性氧信号通路及炎症因子释放的影响

目的观察姜黄素(curcumin,Cur)对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶/活性氧(reactive oxygen species,ROS)信号通路及炎症因子释放的影响。方法原代培养VSMCs分为5组:对照组、LPS组、LPS+姜黄素5μmol/L组、LPS+姜黄素10μmol/L组、LPS+姜黄素30μmol/L组和姜黄素30μmol/L组。MTT法测定不同浓度姜黄素对VSMCs细胞活性的影响;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)蛋白的表达;Real-time PCR法及Wester-blot检测各组细胞TLR4、p22phox蛋白的表达;流式细胞仪测定细胞内ROS的表达。结果姜黄素在0~80μmol/L浓度范围内对细胞活性无显著影响。姜黄素(5、10、30μmol/L)可以有效地抑制LPS诱导的TNF-α和IL-1过分泌和TLR4、p22phox、ROS的高表达并具有浓度依赖性。结论姜黄素能够有效地抑制LPS诱导的VSMCs炎症因子分泌、TLR4表达及其下游NADPH氧化酶、ROS的生成,姜黄素对LPS诱导的VSMCs炎症反应的抑制作用可能部分依赖于TLR4介导的NADPH氧化酶/ROS信号通路。     

迷迭香酸甲酯通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导人肝癌细胞凋亡

目的 探讨迷迭香酸甲酯(methyl rosmarinate, MR)诱导人肝癌细胞(HCC)Hep-3B、SK-Hep1凋亡的作用及其机制。方法 CCK-8法检测各浓度MR(0～200μmol/L)对Hep-3B、SK-Hep1、MIHA细胞的增殖-毒性作用;光学显微镜观察不同浓度MR处理三种细胞后的形态变化;EdU实验及流式细胞术分别检测Hep-3B、SK-Hep1细胞增殖及凋亡情况;Transwell迁移和侵袭实验检测MR对Hep-3B、SK-Hep1细胞迁移与侵袭能力的影响;Western blotting检测凋亡、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况。结果 不同浓度MR(0～200μmol/L)处理Hep-3B、SK-Hep1细胞48 h,其细胞活性呈浓度依赖性显著降低(P<0.01),而对MIHA细胞活性无显著影响(P>0.05),Hep-3B、SK-Hep1细胞MR的IC₅₀分别为102.5μmol/L和99.3μmol/L。MR(0～15...