外泌体在体外对乳腺癌细胞耐药信息传递的作用

目的探讨外泌体(exosomes,EXOs)在乳腺癌细胞间耐药信息的传递作用。方法选用乳腺癌敏感细胞株(MCF-7)及其阿霉素耐药株(MCF-7/ADR)为模型,用超速离心法提取MCF-7/ADR外泌体(ADR/EXO);用透射电子显微镜观察鉴定细胞外泌体形态;运用倒置荧光显微镜观察ADR/EXO与MCF-7细胞的相互作用过程;运用激光共聚焦显微镜观察MCF-7与MCF-7/ADR在Transwell小室共培养60h后细胞内阿霉素药物浓度变化;运用CCK-8法检测ADR/EXO与MCF-7细胞共培养后对阿霉素的IC50的影响;运用RT-PCR检测MCF-7与ADR/EXO共培养后MDR1基因表达水平的变化;运用Western blot法检测MCF-7与ADR/EXO共培养12h和72h后P-gp表达水平的变化。结果透射电子显微镜下,外泌体呈现典型的圆形或椭圆形杯口状结构,直径为40~100nm;用PKH67标记ADR/EXO显示,ADR/EXO是可以被MCF-7细胞摄取;与ADR/EXO共培养后敏感细胞株MCF-7对阿霉素的IC50耐药性升高2.62倍,差异有统计学意义(P<0.05);经过与MCF-7/ADR在Transwell小室中共培养60h后的MCF-7细胞,胞内可见阿霉素聚集减少,核区分布减少,荧光强度减弱;MCF-7+ADR/EXO组MDR1的mRNA表达量明显增加,是MCF-7组的8.69倍,差异有统计学意义(P<0.05);与MCF-7组相比,共培养12h的MCF-7+ADR/EXO组P-gp相对表达量升高4.64倍,差异有统计学意义(P<0.05);与MCF-7组相比,共培养72h的MCF-7+ADR/EXO组P-gp相对表达量升高3.37倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论乳腺癌外泌体可能具有传递耐药信息的作用,耐药细胞外泌体能够使敏感细胞获得一定的耐药性,耐药细胞外泌体向敏感细胞传递P-gp,不仅可以通过蛋白形式进行传递,而且可以通过mRNA的形式进行传递。     

pcDNA3.1(+)/caveolin-1真核表达质粒的构建及其在MCF-7乳腺癌细胞株中的表达

目的明确正常组织和人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1的表达情况,构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1表达质粒,并鉴定其表达。方法 RT-PCR法检测9种正常人体组织及人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1基因的扩增情况;Western blotting法检测MCF-7细胞中caveolin-1蛋白的表达情况。设计克隆引物和表达引物,RT-PCR法扩增caveolin-1基因,用EcoRⅠ+XbaⅠ内切酶消化回收PCR产物和质粒pcDNA3.1(+),连接后构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒。挑选pcDNA3.1(+)/caveolin-1转染感受态细菌后的单菌落进行PCR鉴定,阳性菌落培养后提取质粒行酶切鉴定及测序鉴定。瞬时转染MCF-7细胞后Western blotting检测caveolin-1蛋白的表达情况。结果①9种正常组织中均有caveolin-1基因扩增,MCF-7细胞中无caveolin-1基因扩增且无蛋白表达;②pcD-NA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒转染MCF-7细胞后caveolin-1蛋白表达良好。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒,瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞后caveolin-1表达稳定。     

热疗对膀胱癌细胞BIU-87/HCPT耐药相关基因的影响

目的观察热疗对耐羟基喜树碱膀胱癌细胞株BIU-87/HCPT多药耐药的逆转作用,并探讨其逆转肿瘤多药耐药的机制。方法不同温度条件下热疗、化疗、热疗联合化疗处理耐药膀胱癌细胞株BIU-87/HCPT后,用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡、P-gp、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、谷胱甘肽硫-转移酶π(GST-π)和survivin表达的变化。结果热疗对BIU-87/HCPT细胞具有抑制作用,呈温度依赖性且在43℃时最强。热疗可显著增加羟基喜树碱对BIU-87/HCPT细胞的抑制率,作用呈温度依赖性,热疗明显增加化疗的作用。热疗联合化疗明显减少P-gp、MRP1、GST-π和survivin的表达并呈温度依赖性。结论热疗可促进膀胱癌细胞株BIU-87/HCPT凋亡,增强化疗药物作用,部分逆转膀胱癌细胞的耐药性,减少P-gp、MRP1、GST-π和survivin的表达。     

补骨脂素对乳腺癌干细胞拓扑异构酶Ⅱα表达的影响

目的探讨补骨脂素对乳腺癌干细胞拓扑异构酶Ⅱα(topoisomerase,TopoⅡα)表达的影响。方法选用乳腺癌多药耐药细胞株(MCF-7/ADR)为模型,用免疫磁珠法筛选乳腺癌干细胞;运用光学显微镜观察乳腺癌干细胞生长状态;用CCK-8法检测补骨脂素对乳腺癌干细胞的毒性作用以及阿霉素和阿霉素与补骨脂素联合用药组对乳腺癌干细胞的IC50,计算逆转倍数;运用RT-PCR检测拓扑异构酶Ⅱα基因mRNA表达水平;运用Western blot法检测拓扑异构酶Ⅱα蛋白表达水平。结果在光学显微镜下,乳腺癌干细胞呈球形生长;补骨脂素对乳腺癌干细胞的IC10为(6.77±0.23)μg/mL,IC20为(10.36±0.21)μg/mL;阿霉素对乳腺癌干细胞的IC50为(90.03±3.56)μg/mL,阿霉素与补骨脂素联合用药对乳腺癌干细胞的IC50为(21.47±0.82)μg/mL,逆转倍数为4.19倍;补骨脂素处理后,拓扑异构酶Ⅱα基因mRNA表达水平均升高,与对照组相比,6μg/mL组升高1.9倍(P=0.008,差异有统计学意义),10μg/mL组升高2.7倍(P=0.000,差异有统计学意义);补骨脂素处理后,拓扑异构酶Ⅱα蛋白表达均升高,与对照组相比,6μg/mL组升高1.8倍(P=0.003,差异有统计学意义),10μg/mL组升高2.4倍(P=0.000,差异有统计学意义)。结论补骨脂素能够上调乳腺癌干细胞拓扑异构酶基因和蛋白的表达,增加药物的作用靶点,逆转乳腺癌干细胞对阿霉素的耐药。     

β-catenin依赖性 LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响

目的 探讨β-catenin依赖性LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆全长型LEF-1的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His中,脂质体法转染Hela细胞,G418筛选稳定表达目的 基因的细胞株,Western blot鉴定目的 基因的表达,MTT和平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,裸鼠体内成瘤实验检测β-catenin依赖性LEF-1亚型对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响.结果 成功构建LEF-1真核表达质粒,获得稳定表达β-catenin依赖性LEF-1亚型的HeLa细胞株,转染后的细胞增殖速度加快,凋亡水平降低,体内成瘤能力加强.结论 全长型LEF-亚型的上调表达对于HeLa细胞的部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用.     

MDR1、BCRP和LRP基因在乳腺癌组织中的表达及其意义

目的探讨多药耐药基因(MDR1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)及肺耐药蛋白(LRP)mRNA在乳腺癌组织中的表达及其相互关系,分析它们与乳腺癌临床病理特征的关系。方法采用RT-PCR方法检测2007年1月至2007年12月在宁夏医科大学附属医院手术切除的42例乳腺癌组织、42例癌旁组织及50例乳腺良性病变中MDR1、BCRP和LRP mRNA的表达。结果乳腺癌组织中MDR1、BCRP、LRP mRNA的阳性表达率分别为40.47%、38.09%及61.90%,与癌旁组织及乳腺良性病变组织相比阳性表达率均有统计学差异(P<0.05)。MDR1mRNA表达与绝经状况呈完全正相关(r=0.398,P<0.01),与腋窝淋巴结状况呈完全正相关(r=0.398,P<0.01);BCRP mRNA表达与腋窝淋巴结状况呈正相关(r=0.355,P<0.05);LRP mRNA表达与绝经状况、年龄、腋窝淋巴结状况及肿瘤大小之间均无相关性(P>0.05);MDR1mRNA和BCRP mRNA表达呈正相关(r=0.652,P<0.01),LRP mRNA与MDR1mRNA表达无相关性(r=0.147,P>0.05);LRP mRNA和BCRP mRNA表达无相关性(r=0.111,P>0.05)。2个耐药基因共表达率为47.61%,2种或3种耐药基因共表达率为61.89%。结论乳腺癌组织中存在耐药基因MDR1、BCRP和LRP的表达,单基因和多基因协同作用,以多基因共表达为主;检测MDR1和BCRP基因表达水平可辅助临床判断乳腺癌患者的预后。     

紫杉醇诱导人肺腺癌多药耐药细胞系的建立及DNA polβ、mdr1、mrp1、GST-πl、rp和topo Ⅱ基因的表达

目的体外建立人肺腺癌细胞多药耐药细胞系,观察其生物学特性并探讨其细胞内DNA polβ和多药耐药基因mdr1、mrp1、GST-πl、rp和topo Ⅱ的表达及意义。方法以紫杉醇为诱导药,采用间歇逐步增加剂量法建立人肺腺癌多药耐药细胞系A549/TXL20;MTT法检测A549/TXL20对紫杉醇、顺铂、长春新碱、5-氟尿嘧啶和丝裂霉素的耐药指数(RF);细胞克隆形成法测定A549/TXL20对紫杉醇的敏感性;高效液相色谱测定细胞内紫杉醇的浓度;RT-PCR法测定人肺腺癌多药耐药细胞系A549/TXL20中DNA polβ、mdr1、GST-π、mrp1l、rp和topo Ⅱ的基因表达。结果①A549/TXL20形态不规则,较亲本细胞略小,核/浆比增加,倍增时间没有明显变化;②A549/TXL20对紫杉醇的RF为19.3,对顺铂的RF为67.4,对长春新碱、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素和顺铂等抗癌药物有不同程度的耐药性;③A549/TXL20对紫杉醇的敏感性降低,其紫杉醇的含量较亲本细胞下降;④A549/TXL20细胞中DNA polβ、mdr1、GST-π、mrp1l、rp的基因表达量分别较A549细胞中的表达量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论建立了相对稳定的人肺腺癌多药耐药细胞系A549/TXL20,其耐药机制可能与mdr1、GST-π、mrp1l、rp和DNA polβ基因的高表达有关。     

紫杉醇诱导人肺腺癌多药耐药细胞系的建立及DNA polβ、mdrl、mrpl、GST-π、lrp和topo Ⅱ基因的表达

目的体外建立人肺腺癌细胞多药耐药细胞系，观察其生物学特性并探讨其细胞内DNA polβ和多药耐药基因mdrl、mrpl、GST-π、lrp和topo Ⅱ的表达及意义。方法以紫杉醇为诱导药，采用间歇逐步增加剂量法建立人肺腺癌多药耐药细胞系A549／TXL20；MTT法检测A549／TXL20对紫杉醇、顺铂、长春新碱、5-氟尿嘧啶和丝裂霉素的耐药指数（RF）；细胞克隆形成法测定A549／TXL20对紫杉醇的敏感性；高效液相色谱测定细胞内紫杉醇的浓度；RT-PCR法测定人肺腺癌多药耐药细胞系A549／TXL20中DNA polβ、mdrl、GST-π、mrpl、lrp和topoⅡ的基因表达。站杲①A549／TXL20形态不规则，较亲本细胞略小，核／浆比增加，倍增时间没有明显变化；②A549／TXL20对紫杉醇的RF为19．3，对顺铂的RF为67．4，对长春新碱、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素和顺铂等抗癌药物有不同程度的耐药性；③A549／TXL20对紫杉醇的敏感性降低，其紫杉醇的含量较亲本细胞下降；④A549／TXL20细胞中 DNA polβ、mdrl、GST-π、mrpl、lrp的基因表达量分别较A549细胞中的表达量明显增加，差异具有统计学意义（P〈0．05）。站论建立了相对稳定的人肺腺癌多药耐药细胞系A549／TXL20，其耐药机制可能与mdrl、GST-π、mrpl、lrp和DNA polβ基因的高表达有关。     

竹叶提取物通过调控Akt/HIF-1α通路抑制低氧条件下人乳腺癌MCF-7细胞的恶性生长

目的探究竹叶提取物对低氧条件下人乳腺癌MCF-7细胞恶性生长的影响及分子机制。方法将培养的人乳腺癌MCF-7细胞随机分为正常组、低氧组以及0.2、0.4、0.8μg/mL竹叶提取物组和0.8μg/mL竹叶提取物组+IGF-1组。CCK-8法检测各组细胞的增殖活性变化,RT-PCR和Western blot检测细胞增殖标记蛋白PCNA、Ki-67和MCM2表达,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化。Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和survivin表达;并探讨Akt/HIF-1α通路在竹叶提取物抑制癌细胞生长中的作用。结果竹叶提取物处理后,低氧下MCF-7细胞的增殖活性和PCNA、Ki-67和MCM2的表达显著性降低并呈现剂量依赖性(P<0.01);而细胞G2/M期比例增加(P<0.01);此外,竹叶提取物处理后细胞凋亡率明显增加,同时Bax和caspase-3表达上调,Bcl-2和survivin表达下调(P<0.01);此外,竹叶提取物组Akt/HIF-1α通路中p-Akt和HIF-1α的表达下调(P<0.01),Akt/HIF-1α通路激动剂IGF-1可逆转竹叶提取物对低氧下MCF-7恶性生长的抑制作用。结论竹叶提取物可通过下调Akt/HIF-1α信号通路抑制低氧条件下人乳腺癌MCF-7细胞恶性生长。     

重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响

目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力。