人钠/碘转运体354、395位点基因突变与先天性甲状腺功能减退症的相关性研究

目的　探讨青岛地区婴幼儿先天性甲状腺功能减退症患者中是否存在人钠 /碘转运体 (hNIS)基因 35 4、395位点突变及其基因型频率 ,为婴幼儿先天性甲状腺功能减退症的早期诊断和基因治疗建立理论基础。方法　试验组 4 7例 ,均为青岛市妇女儿童医疗保健中心确诊的先天性甲状腺功能减退症患儿 (年龄 0～ 5岁 ) ,甲状腺显像证实腺体位置及发育基本正常 ,排除甲状腺异位及缺如的病儿。对照组 10 0例 ,为在本院门诊及病房就诊的患儿 (年龄 0～ 5岁 ) ,排除甲状腺疾病及其他内分泌疾病家族史。采外周血抽提基因组DNA ,PCR扩增hNIS基因片段。其中由于T35 4P基因突变本身并没有形成酶切位点 ,本实验采用错配的PCR技术 ,扩增片段长度为 2 0 2bp ,包括完整的外显子 9。取PCR产物进行限制性内切酶(HaeⅢ )消化 ,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳观察结果。G395R基因突变的研究扩增片段长度为 370bp ,包括外显子 9、10。扩增产物进行酶切分析 (BspPI) ,琼脂糖凝胶电泳观察结果。 结果　无论试验组或对照组 ,在hNIS密码子 35 4位均以纯合子ACA出现 ,在hNIS密码子 395位均以纯合子GGA出现。T35 4P突变及G395R突变在本研究的 14 7例对象中均未发现。结论　通过对 4 7名先天性甲状腺功能减退症患儿 (其中包括 1对双胞胎姐妹 ,另有     

先天性厚甲症2型一家系的基因突变研究

目的研究先天性厚甲症的基因突变,从而探讨基因型与表现型之间的关系。方法提取1个先天性厚甲症家系中先证者及其家人的外周血基因组DNA,用聚合酶链反应扩增,产物测序检测。取先证者母亲的皮损做组织病理检查,观察皮损组织的角蛋白17的表达。结果家系中两患者的角蛋白17的1号外显子第275位碱基发生A→G的杂合突变,其突变导致其编码角蛋白17的第92位氨基酸的密码子发生改变,使其编码的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸(N92S)。先证者母亲皮损组织病理检查为多发性脂囊瘤,免疫组化显示角蛋白17阳性表达。结论验证了角蛋白17的1号外显子α螺旋1A区突变在先天性厚甲症发病机制中的重要作用。角蛋白17 1A区突变对脂囊瘤的早发可能存在一定影响,基因型与表型存在一定关联。     

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

目的　探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA 4 )基因外显子 1的 4 9位点和启动子的 318位点多态性与中国人自身免疫性甲状腺病 (AITD)的相关性。方法　共收集 5 0例GD ,4 6例HT患者和 5 0例正常对照静脉血标本提取基因组DNA。采用多聚酶链反应 限制性片段长度多态性分析 (PCR RFLP)方法 ,分别用BbvⅠ和MseⅠ检测外显子 1和启动子的多态性。计算CTLA 4的基因型和等位基因频率。结果　①与正常人相比 ,外显子 1GG纯合子基因型发生频率在AITD组显著高于正常对照组 ;而AA纯合子基因型和AG杂合子基因型发生频率均显著低于正常对照组 ;G等位基因频率显著高于对照 (P <0 .0 1)。②GD患者启动子的CC纯合子基因型发生频率明显高于正常对照 ;CT杂合子基因型发生频率明显低于正常对照 ;C等位基因频率显著高于正常对照 (P<0 .0 1,OR =2 .6 1) ;HT患者虽然有较多的CC基因型及较少的CT基因型 ,但与正常对照无显著性差异。③GD患者启动子为CC纯合子 ,外显子 1为GG基因型显著高于对照 (P <0 .0 1,OR =2 .38) ,计算连锁不平衡系数揭示启动子的C等位基因和外显子 1的G等位基因有连锁不平衡。结论　CTLA 4基因外显子 1G49等位基因与AITD显著相关 ;CTLA 4基因启动子的多态性 (C T)与GD的相关性是由于其与外显子 1连锁不?     

先天性巨结肠与RET基因c135位点单核苷酸多态性相关性分析

目的确定国人陕西地区正常汉族人群中是否存在RET基因c135位点单核苷酸多态性及基因频率,研究先天性巨结肠患儿该位点基因型与表型的相关性,探讨其病因。方法整体抽样随机选取40例陕西西安地区健康汉族献血者血样进行DNA抽提。对16例病理诊断证实为先天性巨结肠患儿狭窄段肠组织标本进行DNA提取(均为陕西地区患儿,汉族,散发性)。PCR扩增RET基因外显子2(含c135片段),长度300 bp,产物纯化后直接测序,并用相关软件及统计学分析。结果陕西地区正常汉族人群存在RET基因c135位点单核苷酸多态性A/G,A、G基因频率分别为0.475、0.525,各等位基因频率接近,G等位基因频率稍占优势。病例组16例A、G基因频率分别为0.844,0.156。病例组基因型以突变型AA(13/16)为主。对照组与病例组存在明显差异(P<0.001)。A等位基因与疾病关联强度OR=5.97,OR95%CI(2.24,15.92),OR值在0.05水平上有显著性。结论国人陕西地区汉族人群RET位点存在单核苷酸多态性A/G,c135G>A。先天性巨结肠表型与该位点A基因型明显相关。RET基因c135位点单核苷酸多态性纯合突变型AA在先天性巨结肠患儿中过高表达。     

多发性内分泌腺肿瘤综合征临诊应对——1个多发性内分泌腺瘤2A型家系报道

目的 对多发性内分泌腺瘤2A型(MEN2A)1个家系进行临床调查及RET原癌基因突变位点筛查,明确疾病诊断、分型,以指导治疗、预防及改善预后。方法 对1个包括6名甲状腺髓样癌先证者在内的共36位成员的MEN2A家系进行临床资料调查,并提取28位家系成员(1位先证者未采血)外周血基因组DNA,对RET基因的第8、10、11、13、14、15、16外显子进行PCR扩增,产物直接测序。结果 RET基因各外显子PCR扩增结果显示,13名家系成员存在RET原癌基因10号外显子错义突变杂合错义突变c.1852T>A,导致618位半胱氨酸(TGC)变为丝氨酸(AGC)(Cys618Ser),其中包括5名先证者及8名家系成员。12名RET基因Cys618Ser突变携带者家系成员均有甲状腺超声改变,并伴随降钙素水平升高。而RET基因Cys618Ser野生型携带者家系成员降钙素水平均正常。病史分析证实2名甲状腺髓样癌先证者伴甲状旁腺功能亢进症,1例RET基因Cys618Ser突变携带者家系成员合并嗜铬细胞瘤,该家系最终确诊为MEN2A。结论 RET基因检测对MEN2A家系患者治疗和随访有指导作用,对...     

西安市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因的突变型分析

目的西安市结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因RRDR的基因型分析。方法采用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析32株结核分枝杆菌耐RFP株和10株RFP敏感株的rpoB基因PCR产物,并对8株具有代表性的菌株rpoB基因片段通过DNA测序进行验证。结果 rpoB基因PCR-SSCP分析灵敏度为56.3%(18/32),特异性为80%(8/10)。8株结核分枝杆菌rpoB基因经测序,6株耐RFP菌株中有5株的rpoB基因突变均发生在531或526密码子上。其中有两株在526密码子均发生了双碱基突变;1株PCR-SSCP呈现阴性的耐RFP结核分枝杆菌存在513密码子突变;两株RFP敏感株出现PCR-SSCP假阳性,其rpoB基因均涉及2～3个密码子的突变,其中518密码子突变型AAC→GAC为首次报道。结论 531和526密码子除了单点突变之外,亦出现同密码子双碱基突变型;RFP敏感株多密码子突变型值得关注。     

人ECK基因外显子3的实验研究

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon 3在肿瘤形成中的作用奠定了基础     

Graves病自身免疫单链抗体库的构建及抗甲状腺单抗的筛选

目的　Graves病属于甲状腺自身免疫性疾病 (AITD) ,其患者血中存在多种抗甲状腺自身抗体 ,其中包括TGAb、TPOAb以及TRAb。单链抗体 (ScFv)是以连接肽将重链可变区基因 (VH)和轻链可变区基因 (VL)连接起来形成的单链小分子抗体。为了获得人源性抗甲状腺抗体 ,分析其基因结构 ,进一步研究AITD的发病机理 ,我们构建了人源性噬菌体ScFv库。方法　采取Graves病人静脉血 ,用淋巴细胞分层液按常规分离单个核细胞。提取淋巴细胞总RNA逆转录合成cDNA。分别扩增出全套的免疫球蛋白VL 链和VH 链基因 ,利用重叠PCR方法 ,构建ScFv基因。重组到 p3SCMH嗜菌粒中 ,电穿孔转化XL1 Blue大肠杆菌。经适当培养后 ,加入约 10 12 空斑形成单位 (PFU)的辅助噬菌体VCSM13,构建噬菌体抗体库。测定库容 ,鉴定重组率。以固相化的抗原对噬菌体ScFv库进行了 4轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,富集特异性噬菌体抗体。用ELISA竞争抑制实验检测富集的噬菌体抗体。结果　以单链cDNA为模板 ,用PCR方法分别扩增VL 链和VH 链的DNA。PCR产物经 15g·L-1琼脂糖电泳检测 ,分别在 380bp和 4 2 0bp左右见到扩增带。将VL 和VH 进行重叠PCR制备ScFv ,琼脂糖电泳显示PCR产物在 80 0bp左右有扩增带。将ScFv基因纯化 ,用SacⅠ+SpeⅠ双酶消化后 ,重组到 p3     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板,扩增Hp UreI基因片段,将目的基因UreI与载体pET32a( )分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切,纯化,连接。筛选阳性重组载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达pET32a( )/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp UreI编码基因,由585 bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致,无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a( )/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白分子量为130 ku,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,Western blot分析显示,该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a( )/UreI,并在原核细胞中得到了高效融合表达。     

HLA等位基因DQA_1~*0501、DQA_1~*0201与自身免疫性甲状腺疾病的相关性

目的　在山东沿海地区自身免疫性甲状腺疾病流行病学调查的基础上 ,应用多聚酶链反应 序列特异性引物 (PCR SSP)技术对HLA等位基因DQA1 0 5 0 1、DQA1 0 2 0 1在GD、HT和正常对照人群中的基因表达频率进行分析 ,以研究山东沿海地区人群HLA DQA1等位基因与GD、HT的相关性。方法　①对象 :AITD组分为GD组 90例 (男 2 2例 ,女 6 8例 ,平均年龄 33.3± 13.0岁 ) ,HT组 4 3例 (男 3例 ,女 4 0例 ,平均年龄 38.2± 15 .1岁 )。正常对照组 6 0例 (男 2 7例 ,女 33例 ,平均年龄 32 .6±12 .0岁 ) ,均来自山东沿海地区 (青岛、烟台、威海、日照 )甲状腺疾病流行病学调查人群和上述地区在青岛大学医学院附属医院就诊的AITD患者。②方法 :( 1)用酚 氯仿三步法抽提人外周血白细胞基因组DNA ;( 2 )采用Olerup等的PCR SSP法扩增HLA DQA1 0 5 0 1和DQA1 0 2 0 1的目的基因片段 (分别为 186bp、170bp)。在PCR扩增仪经 94℃预变性 4min ,94℃变性4 5s,6 0℃退火 5 0s ,72℃延伸 4 5s ,30个循环后 72℃延伸 5min完成扩增反应。将PCR产物在含溴化乙锭的 2 0g·L-1( 2 .0 % )琼脂糖凝胶上电泳 ,80V ,电泳 30min ,在紫外透射仪下观察DNA阳性条带 ,确定基因型。③统计学处理 :将基因型结果输入计算机 ,应用SSPS统计软件计算各?     

CD40基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

目的了解CD40基因多态性在西北地区汉族人群中的分布及其与自身免疫性甲状腺病(AITD)的相关性。方法随机选取本院内分泌科门诊的165例Graves病(GD)患者、113例桥本甲状腺炎(HT)患者为研究对象,以94例健康体查者为对照。①应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术检测CD40基因5′非翻译区-1位点C/T多态性(5′UTR C(-1)T)、第三外显子58038位点-/T多态性;②应用扩增受阻突变系统-聚合酶链反应检测第九外显子64610位点C/G多态性。结果①5′UTR C(-1)T位点中CC基因型、C等位基因在GD组和对照组间有显著差异(P<0.05);②58038位点在372例样本中均为TT型;③64610位点未发现GG基因型。结论①西北地区汉族人CD40基因5′UTR C(-1)T位点上C等位基因型与GD发病有相关性,CC基因型者患GD的危险性较TT高;②58038位点-/T在西北地区汉族人中无多态性;③64610位点C/G在西北地区汉族人中未发现GG基因型。     

GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建

目的构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法将T-h GM-CSF重组质粒转化入感受态大肠杆菌中,筛选出耐药性单克隆菌落送测序。利用PCR技术扩增出GM-CSF目的基因片段,将PCR产物连入pGEM-T easy载体,转化入大肠杆菌中扩增,用SDS碱裂解法提取Teasy-GM-CSF重组质粒,用限制性内切酶酶切Teasy-GM-CSF重组载体,连入经相同酶酶切的pLXSN反转录病毒载体中。用磷酸钙沉淀法转染PA317包装细胞系进行病毒包装,用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19细胞,经G418加压筛选感染成功的NuTu-19/GM-CSF细胞,用免疫细胞化学和ELISA法检测NuTu-19/GM-CSF分泌表达GM-CSF蛋白的情况。结果T-h GM-CSF重组质粒测序结果与GenBank Accession#:NM_000758基因序列对比后确定为人类GM-CSF基因编码序列;PCR产物酶切电泳在Mark 400-500 bp中有一条带,符合GM-CSF基因序列长度;重组Teasy-GM-CSF质粒用EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切后,电泳鉴定在400-500 bp之间有一目的条带,重组反转录病毒质粒pLGM-CSFSN酶切电泳有目的条带;G418加压筛选感染后的NuTu-19细胞,14 d后慢慢形成单克隆继续生长;免疫细胞化学检测到感染成功的NuTu-19细胞膜表面有明显的棕褐色颗粒沉淀,ELISA法检测细胞培养上清液中GM-CSF的质量浓度为150 pg/mL。结论成功构建了能分泌表达人GM-CSF蛋白的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF,为以后研究卵巢癌免疫治疗提供必备、有效、可靠的工具基础。     

CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定。方法采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定。IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定。结果构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku。谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度最高可达94.5%。Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白。结论成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ABP37的反式调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建NS5ABP37反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选NS5ABP37蛋白反式激活相关基因.方法 以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ABP37转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,从转染后的细胞裂解液中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切消化后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应;第2次PCR产物与pGEM-T easy克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果 成功构建了人NS5ABP37蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库.扩增后得到60个200～1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得9种已知功能编码基因.结论 NS5ABP37基因功能涉及细胞生长调节、信号转导和能量代谢.     

人促甲状腺激素受体胞外段的体外重组、蛋白高效表达及其与构象功能的关系

目的　TSH受体 (TSHR)是诱发自身免疫性甲状腺病 (autoimmunethyroiddisease ,AITD)的主要自身抗原。TSHR上TSH结合部位、自身抗体及主要的B细胞、T细胞表位均位于其胞外段部分。本研究利用基因重组方法 ,建立人TSH受体胞外段 (hTSHRecd)体外高效表达、纯化系统 ,用于Graves’病的临床及实验研究 ,探索体外表达的重组hTSHRecd蛋白的免疫生物活性与其空间构象的关系。方法　设计 1对hTSHRecd特异性引物 ,自PCRTTM3 hTSHR载体中PCR扩增合成hTSHRecd片段 ,经限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ消化 ,胶回收纯化后 ,重新构建于表达质粒 pQE 30中。用质粒电泳、限制性内切酶消化、PCR 3种方法鉴定重组质粒是否构建正确 ,并于E .coliM15细胞进行诱导表达。所表达的 6×His hTSHRecd融合蛋白经 12 0 g·L-1SDS PAGE ,Westernblotting鉴定。细菌培养产物经超声波破碎、裂解液裂解后利用Ni NTA树脂 ,经金属螯合层析法纯化 ,并经原位再折叠、透析、浓缩等处理。以ELISA、12 5I TSH结合抑制试验检测纯化蛋白与Graves’甲亢患者血清及TSH的结合活性。结果　经鉴定 ,重组质粒中含有以正确方向插入的 12 0 5bp的hTSHRecdcDNA基因片段。hTSHRecd融合蛋白约 4 7kD ,于 12 0 g·L-1SDS PAGE可见深染的特异性蛋白条带 ,可与Graves?