分子杂交法检测女性尖锐湿疣中的人乳头瘤病毒DNA

本研究以~(32)P标记的重组HPV 11,16,18质粒为探针,采用打点杂交法检测了60例女性尖锐湿疣组织(其中外阴47例,阴道12例、宫颈1例)中的HPVDNA;用限制性内切酶和Southern转印杂交法分析了8例HPV 11 DNA的物理状态。结果检出HPV11 19例,其中外阴13例,阴道5例,宫颈1例,阳性率31.7%;HPV16,18各1例,分别检自阴道和外阴,阳性率均为1.7%;HPV 11均以游离状态存在。这一结果为国内进一步深入研究HPV与生殖器癌之间的关系提供了资料。     

用~3H和地高辛配基标记TNF—α cDNA探针进行原位杂交的比较

用~3H和地高辛配基标记肿瘤坏死因子-αcDNA探针以及原位杂文技术检测33例子宫颈癌和28例阴道尖锐湿疣活检标本中的TNF mRNA。结果表明,两种标记探针原位杂交结果基本一致,~3H标记探针敏感性稍高于地高辛配基标记探针。但放射性核素探针的固有缺点及非同位素探针的安全、快速、方便使非同位素探针有着日益广泛的应用前景。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

用分子杂交法探讨HSV、HPV与宫颈癌的相关性

宫颈癌的流行病学特点提示癌的发生与感染因素有关。主要涉及两组病毒:单纯疱疹病毒(HSV)和人乳头瘤病毒(HPV)。为了探讨HSV、HPV 与宫颈癌的关系,我们以~(32)P 标记HSV—2DNA 和HPV DNA,分别用Southern 转印和打点杂交技术,同时检测了73例宫颈癌和14例正常宫颈活检标本。在严格状态下杂交,65例宫颈癌中未发现HSV—2DNA,其中19例癌组织RNA 与HSV—2DNA 杂交阳性。研究发现与宫颈癌组织RNA 杂交阳性的HSV—2DNA 位于0.2～0.33,0.58～0.625图谱单位。此外,在25例宫颈癌中检出了HPV_(16) DNA,2例标本检出了HPV_(18) DNA。在非严格状态下杂交,8例经PstⅠ酶切的宫颈癌组织DNA,Southern 转印后分别与HPV_(16) DNA 和HSV—2BglⅡ克隆片段杂交。结果,6例检出了HPV_(16)DNA,1例既检出了HPV_(16)DNA,又检出了HSV—2DNA。初步结果说明HPV、HSV—2与宫颈癌的发生可能有关。     

HPV_(16)DNA以游离状态存在于宫颈癌组织中

<正> 作者等用分子杂交法探讨HSV-2、HPV与宫颈癌的相关性,以[~(2_32)P]dATP标记HSV-2 DNA和HPVDNA,分别用Southern转印和打点杂交技术,检测了73例宫颈癌和14例正常宫颈活检标本。在严格状态下杂交,65例宫颈癌中未发现HSV-2DNA,其中19例癌组织RNA与HSV-2 DNA杂交阳性     

不同探针在制备HLA-DRB1-12亚型点突变芯片中的比较

目的　探讨寡核苷酸芯片检测点突变过程中 ,不同类型探针在预先化学处理的玻片表面上固定效率的不同对于杂交信号的影响。方法　根据HLA DRB1 12亚型的基因序列设计四种 5′末端不同化学基团修饰的探针 ,通过与醛基化玻片和溴化玻片结合形成两种寡核苷酸微阵列芯片 ,与不对称荧光标记的目的片段杂交 ,通过荧光信号的强度判断最佳类型探针。在此基础上进一步设计两组四种碱基突变探针 ,根据杂交结果 ,判断最佳检测突变探针。结果　 5′末端氨基探针和硫代探针可以分别固定在两种类型的玻片上 ,溴化芯片中杂交信号强于醛基化芯片的杂交信号。其中 5′末端带有连接臂的氨基探针在检测点突变中阳性信号同阴性信号比值要高于 5′末端硫代探针 ,重复实验判型结果稳定一致。结论　溴化芯片中 5′末端带有连接臂的氨基探针在检测点突变中具有更明显的优势 ,为进一步的研究和制备点突变寡核苷酸芯片提供了条件     

用HPV L_1区共有引物及PCR技术检查人尖锐湿疣和子宫颈癌中的HPV

根据HPV6、11、16、18、31、33型L1ORF高度保守区的基因序列设计合成了一对HPVL1区共有引物。该引物除与上述六型有很高的同源性外还可覆盖其它已知的20多型与女性肛生殖区感染有关的HPV。用该引物及PCR技术对一组计144例活检标本进行检测，结果显示：病理确诊的尖锐湿疣、子宫颈癌及外阴癌组织、正常宫颈标本中HPVDNA序列检出率分别为100％（55／55）、70％（28／40）和13．3％（2／15）。另外，34例临床诊断而未被病理证实的尖锐湿疣HPV－DNA亦呈阳性，说明在对这类病变进行病理诊断时有必要进行病原学检测。     

女性外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的相关性

目的研究外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的关系。方法收集西安交通大学医学院第二附属医院手术治疗的44例女性外阴病变患者的临床病理资料,包括鳞癌11例,鳞状上皮内瘤变(VIN)10例,尖锐湿疣9例及白色病变14例。采用免疫组化SP方法检测HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白的表达。结果①4组外阴病变患者年龄中位数依次为:外阴鳞癌61岁、VIN 45.5岁、尖锐湿疣24岁、外阴白色病44岁,尖锐湿疣组中位年龄低于外阴鳞癌组及白色病变组(P<0.05),其余各组间中位年龄无统计学差异。②HPV16/18E6蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组及外阴鳞癌组的阳性率分别为2/14、3/9、3/10、8/11,外阴鳞癌组高于白色病变组(P<0.05),其余各组间无统计学差异;HPV6L1蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组、外阴鳞癌组的阳性率分别为1/14、8/9、4/10、3/11,尖锐湿疣组高于其他各外阴病变组(P<0.05),其余各组间比较差异无统计学意义。③HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白在早期外阴鳞癌的阳性率均高于中晚期(P<0.05);HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白表达均与外阴鳞癌的组织学分级、年龄分组、绝经情况、产次不相关(P>0.05);HPV16/18E6蛋白与HPV6L1蛋白在外阴鳞癌中的表达不相关(P>0.05)。结论外阴病变的发病与年龄及HPV16/18、HPV6感染有关;外阴鳞癌中HPV16/18、HPV6的感染率与FIGO分期有关,HPV16/18感染率与HPV6的感染率无关。     

HLA-I类基因多态性与白血病易感性的关联性研究

目的探讨白血病易感性与HLA-I类基因多态性之间的关联性,寻找白血病的易感基因。方法采用序列特异性寡核苷酸探针杂交技术(PCR-SSO)对65例白血病患者和48例正常对照组健康者进行HLA-A、B基因分型。结果在等位基因HLA-A、B中,白血病患者的HLA-A01、B38基因的基因频率高于正常对照组(P<0.05),而HLA-A11基因的基因频率明显下降(P<0.05)。结论基因A01、B38对白血病有遗传易感作用,而基因A11对白血病有遗传拮抗作用。     

应用DNA PCR法扩增检测苯丙酮尿症基因突变

本文应用PCR和核酸杂交技术,在西安地区14例PKU患儿中检测了目前中国人中唯一确定引起PKU的PAH基因外显子3终止突变,结果发现这些患者的PAH基因均无终止突变,提示在我国有可能因PAH基因其它部位突变导致PKU的发生。我们体会DNA体外PCR扩增结合寡核苷酸探针点杂交方法可用于PKU的产前诊断和携带者检出。     

尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒亚临床感染及潜伏感染的研究

用多聚酶链反应方法（PCR）检测30例生殖器尖锐湿疣（CA）患者临床皮损、醋酸白试验阳性及阴性的非皮损区刮屑及尿道拭子中人乳头瘤病毒（HPV）。结果：CA临床皮损HPV29例阳性，阳性率96．60％，醋酸白试验阳性的非皮损区HPV22例阳性，阳性率73.3％，醋酸白试验阴性的非皮损区HPV21例阳性，阳性率70％，尿道拭子HPV18例阳性,阳性率60％。结果表明CA患者非皮损区及尿道内均存在HPV潜伏感染，HPV潜伏感染在CA复发中起着很重要的作用。     

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的　为构建人乳头瘤病毒 1 1型 (HPV1 1 )DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法　利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA ,采用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因克隆。结果　从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 1 1型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体T easy中构建重组质粒 ,转化JM1 0 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。结论　该实验的成功为下一步制备HPV1 1的治疗性疫苗奠定基础。     

用聚合酶链反应检测口腔癌组织中人乳头状瘤病毒的E_6转化基因

作者采用聚合酶链反应（ＰＣＲ），并对照核酸斑点杂交法对１０例口腔恶性肿瘤组织中ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因进行了检测。这些肿瘤包括６例口腔粘膜鳞癌（ＳＣＣ），２例涎腺腺样囊性癌（ＡＣＣ），１例涎腺恶性多形性腺瘤（ＭＰＡ）和１例腭部软组织胚胎性横纹肌肉瘤（ＥＲ）。对照组为１０例非肿瘤组织，包括唇裂、腭裂粘膜组织标本各５例。结果表明两种方法检测结果基本一致，肿瘤组阳性６例（６／１０），包括４例ＳＳＣ，１例ＡＣＣ和１例ＥＲ（除外１例ＡＣＣ用核酸杂交法检测为弱阳性），其余为阴性；对照组用核酸杂交法检测４例，除１例唇裂标本为弱阳性以外，均为阴性（０／４）；用ＰＣＲ法检测１０例均为阴性结果（０／１０）。两组间ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因的检出率有明显差异（Ｐ＜０．０５）。这一结果为开展口腔癌的ＨＰＶ病因学研究提供了参考资料。     

皮损内注射干扰素治疗尖锐湿疣的疗效观察

应用皮损内注射α－干扰素合并二氧化碳激光治疗的方法，对４０例尖锐湿疣患者进行治疗，对照组肌肉注射干扰素合并激光治疗。结果表明治疗组的复发率明显低于对照组。所以，认为皮损内注射干扰素能明显提高治愈率，降低复发率。     

涎腺肿瘤组织中人乳头瘤病毒DNA的检测

为探讨腺上皮起源的涎腺良、恶性肿瘤与人乳头瘤病毒（Ｈｕｍ ａｎ ｐａｐｉｌｌｏ ｍ ａｖｉｒｕｓ, ＨＰＶ）感染的关系,应用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）,采用共有引物检测４４例涎腺肿瘤组织中的ＨＰＶ ＤＮＡ的存在状况。１０ 例正常涎腺组织作为对照。结果显示：肿瘤组织中ＨＰＶ ＤＮＡ 阳性检出率达７０．４５％ （３１／４４）,其中恶性肿瘤 ＨＰＶＤＮＡ 阳性率为７７２７％ （３１／４４）;良性肿瘤ＨＰＶＤＮＡ阳性率为６３６３％ （１４／２２）;而正常对照组织中ＨＰＶ ＤＮＡ阳性率仅为１０％ （１／１０）。提示：涎腺肿瘤的发生可能与ＨＰＶ感染有关