K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌靶基因表达的抑制作用

目的　观察针对于胰腺癌K ras基因点突变的反义寡核苷酸对靶基因表达的抑制作用。方法　脂质体将人工合成的针对于K ras基因第 12位密码子点突变的反义寡核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC 2 ,用免疫组化和原位杂交技术检测靶基因的表达。结果　转染 4 8h后 ,反义寡核苷酸作用组胰腺癌细胞株PC 2的ras蛋白和K rasmRNA的表达程度较正义组和对照组均明显降低 (P <0 .0 5 )。结论　针对于K ras基因点突变的反义寡核苷酸作用于体外培养的胰腺癌细胞 ,对靶基因的表达有明显的抑制作用     

血红素氧合酶-1对胰腺癌细胞增殖的促进作用

目的探讨血红素氧合酶-1(HO-1)对胰腺癌培养细胞增殖能力的影响。方法应用Real-time PCR检测胰腺癌细胞中HO-1 mRNA的表达;应用免疫荧光化学染色和Western blot检测细胞中HO-1定位表达和定量表达;应用基因转染技术构建高表达HO-1的Miapaca-2胰腺癌细胞株和低表达HO-1的Panc-1胰腺癌细胞株,并用MTT法检测胰腺癌细胞的增殖能力变化。结果胰腺癌细胞中存在HO-1的表达,通过在体外实验筛选和构建HO-1不同表达水平的胰腺癌细胞株,结果显示在人胰腺癌Panc-1细胞中,应用ZnPPIX和转染细胞Panc-1-Si-HO-1能够明显抑制胰腺癌细胞的增殖。在Miapaca-2细胞中,应用ZnPPIX明显抑制了胰腺癌细胞的增殖,而Miapaca-2-Sh-HO-1可显著促进胰腺癌细胞增殖。结论 HO-1能明显促进胰腺癌细胞的增殖能力。     

脂肪酸合成酶在胰腺癌细胞凋亡过程中的作用

目的探讨脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)对胰腺癌细胞凋亡的影响及其可能的分子机制。方法应用Annexin V/FITC流式细胞仪检测脂肪酸合成酶受到抑制后对胰腺癌细胞株PANC-1凋亡水平的影响,qRTPCR、Western blot技术检测受到C75作用后的胰腺癌细胞PANC-1中Caspase-3、Bcl-2、FASN蛋白及RNA的水平。结果应用C75对PANC-1细胞中FASN进行特异性地抑制,随着C75浓度增加,胰腺癌细胞中脂肪酸合成酶蛋白表达量明显降低,细胞凋亡水平升高。同时,C75处理组Caspase-3分子水平较对照组升高,Bcl-2分子水平下降(P<0.05)。结论脂肪酸合成酶通过Bcl-2以及Caspase-3分子,参与了胰腺癌细胞株PANC-1中细胞凋亡的过程。因此,脂肪酸合成酶在未来可以作为药物靶点,用于临床治疗胰腺癌。     

人钠/碘转运体354、395位点基因突变与先天性甲状腺功能减退症的相关性研究

目的　探讨青岛地区婴幼儿先天性甲状腺功能减退症患者中是否存在人钠 /碘转运体 (hNIS)基因 35 4、395位点突变及其基因型频率 ,为婴幼儿先天性甲状腺功能减退症的早期诊断和基因治疗建立理论基础。方法　试验组 4 7例 ,均为青岛市妇女儿童医疗保健中心确诊的先天性甲状腺功能减退症患儿 (年龄 0～ 5岁 ) ,甲状腺显像证实腺体位置及发育基本正常 ,排除甲状腺异位及缺如的病儿。对照组 10 0例 ,为在本院门诊及病房就诊的患儿 (年龄 0～ 5岁 ) ,排除甲状腺疾病及其他内分泌疾病家族史。采外周血抽提基因组DNA ,PCR扩增hNIS基因片段。其中由于T35 4P基因突变本身并没有形成酶切位点 ,本实验采用错配的PCR技术 ,扩增片段长度为 2 0 2bp ,包括完整的外显子 9。取PCR产物进行限制性内切酶(HaeⅢ )消化 ,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳观察结果。G395R基因突变的研究扩增片段长度为 370bp ,包括外显子 9、10。扩增产物进行酶切分析 (BspPI) ,琼脂糖凝胶电泳观察结果。 结果　无论试验组或对照组 ,在hNIS密码子 35 4位均以纯合子ACA出现 ,在hNIS密码子 395位均以纯合子GGA出现。T35 4P突变及G395R突变在本研究的 14 7例对象中均未发现。结论　通过对 4 7名先天性甲状腺功能减退症患儿 (其中包括 1对双胞胎姐妹 ,另有     

慢性乙肝患者HBV核心蛋白启动子变异的初步研究

目的　通过对乙型肝炎病毒 (HBV)基本核心基因启动子 (BCP)变异的研究 ,阐明HBV准种在慢性感染者中存在的意义。方法　以中国株HBV基因序列为依据 ,设计特异性多聚酶链反应 (PCR)引物 ,自 4 0例慢性HBV感染患者血清中扩增HBV的BCP基因 ,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)技术展示缺失突变 ,DNA测序确定病毒的变异程度。结果　聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现 ,6 0 % (2 4 / 4 0 )患者血清中可见 2～ 3条扩增条带 ;测序结果发现BCP区存在多种突变形式 :点突变中以 14 0nt(T→C)最为常见 ,缺失突变多见于TA1,TA2及TA3,多表现为 8bp和 2 0bp的缺失。 结论　HBVBCP区内有一缺失高变区 ,并在患者体内存有多种变异形式 ;TA1,TA2和TA3的变异可能影响e抗原的表达。HBV慢性携带者体内有HBV准种共存     

人ECK基因外显子3的实验研究

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon 3在肿瘤形成中的作用奠定了基础     

髓样细胞白血病-1基因在多发性骨髓瘤发病中的分子机制

目的通过检测骨髓瘤细胞中依赖IL-6与否的髓样细胞白血病-1(mcl-1)基因的表达,阐明mcl-1基因在多发性骨髓瘤发病中的信号转导通路。方法应用JAK特异性抑制剂AG490、蛋白激酶抑制剂LY294002、ERK1/2信号通路的特异性阻断剂PD98059,分别研究了JAK/STAT通路、ras/MAPK通路及PI3K/Akt三大信号途径与mcl-1基因在多发性骨髓瘤中的关系。结果在骨髓瘤细胞8226和U266中,抑制ERK1/2活性不能改变mcl-1的表达;高浓度的AG490不能抑制STAT3的酪氨酸磷酸化;LY294002可抑制8226细胞和ANBL-6细胞的增殖,但不抑制mcl-1的表达。结论 Ras/MAPK通路以及PI3K通路在mcl-1基因的调节中无作用,但STAT的作用仍然需要进一步探讨。     

PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型

目的　研究用PCR SSP法鉴定胎儿、新生儿血型及基因型。方法　用PCR SSP法检测 5 6例 16周以上孕妇的胎儿、新生儿脐血红细胞基因型 ;用常规法检测双亲及胎儿、新生儿血红细胞ABO血型。结果　用PCR SSP法检测出全部 5 6例脐血ABO血型及基因型 ;PCR SSP法检测出的子代血型与由父母血型按孟德尔遗传规律推测的子代血型符合率达 10 0 % ;用常规法检测脐血ABO血型 ,检出率为 87.5 %。结论　PCR SSP法检测子代ABO血型方法可靠 ,且可鉴定出其亚型     

人钠／碘转运体354、395位点基因突变与先天性甲状腺功能减迟症的相关性研究

目的 探讨青岛地区婴幼儿先天性甲状腺功能减退症患者中是否存在人钠／碘转运体(hNIS)基因354、395位点突变及其基因型频率，为婴幼儿先天性甲状腺功能减退症的早期诊断和基因治疗建立理论基础。方法 试验组47例，均为青岛市妇女儿童医疗保健中心确诊的先天性甲状腺功能减退症患儿(年龄0—5岁)，甲状腺显像证实腺体位置及发育基本正常，排除甲状腺异位及缺如的病儿。对照组100例，为在本院门诊及病房就诊的患儿(年龄0—5岁)，排除甲状腺疾病及其他内分泌疾病家族史。采外周血抽提基因组DNA，PCR扩增hNIS基因片段。其中由于T354P基因突变本身并没有形成酶切位点，本实验采用错配的PCR技术，扩增片段长度为202bp，包括完整的外显子9。取PCR产物进行限制性内切酶(HaeⅢ)消化，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳观察结果。G395R基因突变的研究扩增片段长度为370bp，包括外显子9、10。扩增产物进行酶切分析(BspPI)，琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果 无论试验组或对照组，在hNIS密码子354位均以纯合子ACA出现，在hNIS密码子395位均以纯合子GGA出现。G354P突变及G395R突变在本研究的147例对象中均末发现。结论 通过对47名先天性甲状腺功能减退症患儿(其中包括1对双胞胎姐妹，另有两名患儿近亲中有先天性甲状腺功能减退症病人)及100名健康对照者进行hNIS基因突变分析表明，hNIS基因T354P、G395R突变不是引起青岛地区先天性甲状腺功能减退症发病的主要原因。     

酪酪肽对胰腺癌细胞生长的抑制作用及Y受体在胰腺癌细胞的表达

目的 观察酪酪肽(PYY)对体外培养的人胰腺癌Miapaca-2细胞的生长抑制作用及Y受体在胰腺癌细胞的表达.方法 不同浓度的PYY分别作用于体外常规培养Miapaca-2细胞,采用MTT比色法检测细胞增殖情况,光镜观察细胞形态变化.RT-PCR法检测胰腺癌细胞Y受体亚型Y1、Y2、Y5mRNA表达.结果 PYY对Mi...     

K-ras基因点突变在非小细胞肺癌中的意义

目的探讨K-ras基因点突变在非小细胞肺癌中的临床意义。方法应用聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性分析技术检测41例非小细胞肺癌（NSCLc），21例肺癌癌旁正常肺组织和21例肺癌支气管旁淋巴结组织中K-ras基因第12位密码子点突变。结果41例NSCLC中有10例K-ras基因点突变，发生率为24.39％。K-ras基因点突变同患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、临床分期和肿瘤类型无明显关系，吸烟组K-ras基因点突变率高于非吸烟组，但统计学处理无显著性差异，进一步分层比较发现肺腺癌K-ras基因点突变与吸烟有密切关系，但与吸烟量大小及时间长短无关。21例肺癌支气管旁淋巴结组织中检出4例K-ras基因点突变，均为转移淋巴结。K-ras基因突变组死亡率明显高于非突变组，统计学处理有显著性差异（P〈0.05）。结论K-ras基因第12位密码子点突变在NSCLC的发病机制中起重要作用，是影响肺癌预后的独立因素。吸烟是肺腺癌中K-ras基因点突变的一个重要因素。     

DETECTING LOW DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR MUTANT GENE OF RABBIT BY PCR

Objective Watanabe Heritable Hyperlipidaemic （WHHL） rabbits with low density lipoprotein receptor （LDLr） gene mutation have provided unprecedented opportunities for the study of human atherusclerusis, in order to confirm LDL receptor gene status in rabbits, we developed a simple PCR technique to detect LDL mutations in rabbits. Methods Rabbits genomic DNA were extracted from ear biopsy, and amplified by PCR to detect 12 bp deletion mutation in WHHL rabbits. PCR products were directly digested with Bgl Ⅰ, and then applied to polyacrylamide gel electrophoresis. Results PCR products from homozygous LDLr ＋/＋ rabbits generated 2 bands of 212 and 94 bp after Bgl Ⅰ digestion, LDLr ＋/- rabbits generated 3 bands （294, 212, and 94 bp）, LDLr -/- animals, however, generated only 1 product （294 bp）. Conclusion This modified PCR method is simple and reliable.     

STUDY OF ECK GENE EXON-3 FROM HUMAN NORMAL TISSUE AND BREAST CANCER CELL LINE

ECK (epithelialcellkinase) ,alsonamedasEphA 2 ,isoneofthemembersofEphAsubfamilyinEphfamily .ECK protein ,atransmembranety rosinekinase[1] ,canbestructurallydividedintothreedomainsaccordingtotheirpositionsincells.ThreedomainsareexternaldomainwithanN ter minalsignalpeptide ,atransmembranedomainandacytoplasmicdomainwhichincludesacanonicalpro tein tyrosinekinasecatalyticdomain .ECKiswide lyexpressedinavarietyofhumantissues ,abun dantly presentinlung ,skin ,smallintestineandovary .ECKisalsoe…     

人脑源性神经营养因子基因克隆及序列分析

目的　克隆人脑源性神经营养因子 (hBDNF)基因并进行序列分析。方法　提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板 ,应用PCR技术和T 载体克隆法克隆hBDNF基因 ,筛选阳性克隆、酶切鉴定 ,并进行序列测定和分析。结果　DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列 (M6 1 1 81 )比较 ,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744bp ,序列完全相同。结论　自人基因组DNA中克隆hBDNF基因 ,为进一步开展阿尔茨海默病 (AD)的基因治疗积累了资料。     

西安市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因的突变型分析

目的西安市结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因RRDR的基因型分析。方法采用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析32株结核分枝杆菌耐RFP株和10株RFP敏感株的rpoB基因PCR产物,并对8株具有代表性的菌株rpoB基因片段通过DNA测序进行验证。结果 rpoB基因PCR-SSCP分析灵敏度为56.3%(18/32),特异性为80%(8/10)。8株结核分枝杆菌rpoB基因经测序,6株耐RFP菌株中有5株的rpoB基因突变均发生在531或526密码子上。其中有两株在526密码子均发生了双碱基突变;1株PCR-SSCP呈现阴性的耐RFP结核分枝杆菌存在513密码子突变;两株RFP敏感株出现PCR-SSCP假阳性,其rpoB基因均涉及2～3个密码子的突变,其中518密码子突变型AAC→GAC为首次报道。结论 531和526密码子除了单点突变之外,亦出现同密码子双碱基突变型;RFP敏感株多密码子突变型值得关注。     

高血压病患者胰岛素受体基因第20外显子突变的检测

检测高血压病患者是否存在胰岛素受体基因第 2 0外显子突变。方法　以高血压病患者为观察对象 ,用 PCR- SSCP方法检测胰岛素受体基因突变。结果　在 1 1 6例原发性高血压患者中 ,未发现胰岛素受体基因第 2 0外显子存在突变。结论　高血压患者胰岛素受体基因第2 0外显子突变可能并不常见     

重组人单链白细胞介素12融合基因(rhscIL-12)的构建和真核表达

克隆人 IL - 1 2 ( h IL - 1 2 ) p40和 p35亚单位 c DNA,构建人单链 IL- 1 2 ( rhsc IL- 1 2 )融合基因 ,并在哺乳动物细胞中进行表达。方法　从经 PDBu刺激的 EBV转化的人 B淋巴母细胞株 NC37中提取 m RNA,经 RT- PCR分别获得 h IL- 1 2 p40和 p35亚单位编码序列的 c DNA,运用重组 PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头 ( Gly4 Ser) 3 DNA序列进行体外基因重组 ,构建 rhsc IL- 1 2融合基因 ,将其插入 pc DNA3.1 ( + )真核表达载体 ,经脂质体转染 COS7细胞进行表达 ,Western blot进行分析。结果　所克隆的 h IL- 1 2 p40、p35c DNA序列和构建的 rhsc IL - 1 2融合基因 DNA序列均经测序得以证实 ,融合基因可在 COS7中表达其产物 rhsc IL- 1 2融合蛋白 ,其分子量为 70 KD,可与鼠抗人 IL - 1 2 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论　本研究结果为进一步探讨 rhsc IL- 1 2融合蛋白的生物学活性和特性奠定了基础 ,也为 rhsc IL- 1 2融合基因在原核细胞中的表达提供了可能性