人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。     

转移人端粒酶逆转录酶基因的实验研究

目的　转移人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT基因 ) ,建立其转移体系。方法　用脂质体转染的方法将逆转录病毒载体PLNC hTERT转入 ψ 2细胞 ,用产病毒的 ψ 2细胞克隆培养上清重复感染PA317细胞 ,建立产毒PA317/hTERT细胞 ;通过感染内皮细胞检测基因转移效果。结果　ψ 2细胞培养上清重复感染 ,使PA317细胞所产病毒滴度提高 2 0倍 ,得到高滴度的PA317/hTERT包装细胞系。用该细胞系产生的病毒上清感染内皮细胞成功。结论　可通过重复感染法建立高效的逆转录病毒基因转移系统     

肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体对肝癌细胞的杀伤作用

为研究抗肝癌单链抗体（scFV）基因在肝癌细胞内表达对肝癌细胞的作用，采用脂质体转染技术把含抗人肝癌scFV基因的逆转录病毒载体导入人肝癌细胞系HCC9204中。G418筛选阳性细胞克隆。RNAdotblot杂交分析scFV基因在HCC细胞中的表达。光镜及电镜技术观察转染细胞结构的变化。流式细胞仪检测转染细胞的增殖活性。结果：抗人肝癌scFV在人肝癌细胞系HCC9204中稳定有效表达。流式细胞测定出现亚G1期死亡细胞峰；光镜下表现为细胞疏松，胞浆空泡变性，瘤巨细胞增多。电镜分析表现为细胞表面微绒毛显著减少，线粒体及内质网空泡变性，细胞死亡明显。提示：肝癌细胞内表达抗肝癌scFV对肝癌细胞有明显杀伤作用，为肝癌基因治疗提供一种新方法。     

乙型肝炎病毒全X基因对HEK293细胞功能的影响

目的克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异。方法应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;Annexin V流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化。结果成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)%和(0.805±0.013)%,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)%和未转染对照组(0.681±0.018)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)%及(21.34±2.16)%,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)%及未转染细胞对照组(11.37±1.58)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用。     

β-catenin依赖性 LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响

目的 探讨β-catenin依赖性LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆全长型LEF-1的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His中,脂质体法转染Hela细胞,G418筛选稳定表达目的 基因的细胞株,Western blot鉴定目的 基因的表达,MTT和平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,裸鼠体内成瘤实验检测β-catenin依赖性LEF-1亚型对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响.结果 成功构建LEF-1真核表达质粒,获得稳定表达β-catenin依赖性LEF-1亚型的HeLa细胞株,转染后的细胞增殖速度加快,凋亡水平降低,体内成瘤能力加强.结论 全长型LEF-亚型的上调表达对于HeLa细胞的部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用.     

Twist表达增强乳腺癌MCF-7细胞的多药耐药性

目的探讨MCF-7/Twist稳定表达细胞株的多药耐药性。方法 MCF-7细胞中转染Twist,G418筛选,建立稳定表达细胞株MCF-7/Twist,Western blotting法检测Twist表达;观察增殖状态;MTT法测阿霉素、紫杉醇、长春新碱和羟喜树碱对细胞株增殖活性的影响,分析稳定转染细胞株对药物的敏感性;应用RT-PCR及Western blotting方法,检测耐药相关糖蛋白P-gp和乳腺癌耐药蛋白BCRP转录水平和蛋白水平的变化。结果 G418筛选获得稳定表达Twist的细胞株,对阿霉素、紫杉醇、长春新碱和羟喜树碱具有明显耐药性,耐药相关分子P-gp和BCRP转录和表达明显升高。结论 Twist表达增强乳腺癌细胞的多药耐药性,多药耐药性相关分子的转录和表达升高与耐药性增强现象一致。     

Nucleostemin基因特异性RNA干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨应用RNA干扰技术抑制nucleostemin(NS)基因表达对胃癌SGC-7901细胞株增殖和凋亡的影响.方法 阳离子脂质体法将构建好的NS siRNA表达载体转染胃癌SGC-7901细胞株,采用MTT法测试各组细胞增殖抑制率;RT-PCR法检测各组细胞NS基因表达情况,流式细胞术检测细胞周期,Annexin V FITC/PI法检测细胞凋亡率.结果 与对照组相比,S组细胞的增殖减慢,24、48、72h细胞增殖抑制率分别为53.21%、71.54%、87.47%;NS基因表达量下降,G0/G1期细胞百分率显著升高(58.34%),S期细胞减少(20.68%),细胞凋亡率增加(26.85%).结论 RNA干扰技术可抑制胃癌SGC 7901细胞株NS基因的表达,使细胞增殖减慢,细胞周期阻滞在G0/G1期,凋亡率增加.     

survivin-siRNA质粒的构建及其抑制survivin基因在Hela细胞中的表达

目的 合成、克隆、筛选survivin-siRNA干扰片段,构建含有survivin-siRNA的骨架质粒,明确其抑制survivin基因在Hela细胞中表达.方法 利用RNA干扰方法构建真核表达载体pGenesill.1-survivin-siRNA.体外培养人宫颈癌Hela细胞,利用脂质体法将该质粒转染Hela细胞.利用Western blot法检测该质粒转染后survivin基因的表达,筛选最佳干扰质粒.通过MTT法检测Hela细胞的生长.通过流式细胞学技术检测细胞凋亡率.结果 成功构建及筛选出survivin-siRNA质粒.MTT实验及流式细胞学实验'证实该质粒体外能够有效诱导细胞凋亡.结论 成功构建survivin-siRNA质粒,为今后应用该质粒进行宫颈癌的基冈治疗提供了实验基础.     

新基因Clorf63功能的初步研究

目的 检测Clorf63基因在肝癌和癌旁组织中的定位,以及Clorf63在多种人肝癌细胞系和人胃癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平;检测干涉Clorf63后对人胃癌细胞MKN28的细胞周期的影响.方法 免疫组化染色法检测Clorf63基因在组织中的定位;Real-time PCR和Western blot分别检测Clorf63基因在细胞中的表达;脂质体转染法将干涉片段转染至MKN28细胞中,Real-time PCR和Western blot法筛选有效干涉片段;流式细胞术检测Clorf63干涉后对MKN28细胞的细胞周期的影响.结果 Clorf63在肝癌和癌旁组织细胞中都有胞浆表达,在MKN28细胞中表达量较高,在MKN45细胞中表达量较低;成功筛选出Clorf63基因的有效干涉片段;Clorf63干涉后,胃癌细胞MKN28发生G1期阻滞,经统计学分析,Clorf63干涉后MKN28细胞增殖指数降低(P＜0.05).结论 Clorf63在人肝癌和癌旁组织细胞胞浆中都有表达,在MKN28细胞中表达量最高;干涉Clorf63基因后,可使MKN28细胞发生G1期阻滞,为该基因功能的后续研究奠定了基础.     

As2O3诱导人卵巢癌细胞株HO8910凋亡和端粒酶活性的关系

目的探讨As2O3诱导HO8910细胞凋亡和端粒酶活性变化的关系。方法用不同浓度的As2O3溶液作用卵巢癌细胞株HO8910,于不同时间点收集细胞,MTT法检测细胞生长抑制率;FCM检测细胞凋亡率;TRAP-银染法观察端粒酶活性的变化。结果As2O3溶液对HO8910有生长抑制和诱导凋亡的作用,与药物浓度和作用时间相关。不同浓度As2O3作用HO8910细胞,其端粒酶活性在24h无明显改变,随着作用时间的延长,端粒酶活性逐渐下降,随着药物浓度的升高端粒酶活性也呈不断下降趋势,以致消失。结论As2O3可以诱导卵巢癌细胞株HO8910发生凋亡,其机制可能不是通过端粒酶活性下降直接调控的,但端粒酶调控与凋亡调控有一定相关性。