人肺腺癌细胞系A549细胞双向电泳-飞行时间质谱研究

目的初步分析人肺腺癌细胞系A549细胞蛋白质表达情况,从蛋白组水平探讨肺腺癌发病的分子机制。方法应用2-DE技术对人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白进行分离,获得蛋白质表达谱;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)结合生物信息学进行蛋白质鉴定。结果3块胶平均蛋白斑点数为1 138±49,平均匹配点数为986±32,匹配率为85.8%。随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高的20个斑点进行MALDI-TOF-MS分析,共获得了18个肽质量指纹图谱(PMF)。将PMFs质量数据通过Aldente软件查询SWISS-PROT数据库,根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率等,初步鉴定出15种蛋白质。根据功能,这些蛋白质可分为:①基本代谢相关的酶类:果糖2-磷酸醛缩酶、视网醛脱氢酶1(RALDH1)、吡多醛激酶;②细胞骨架类:蛋白细胞角蛋白8(CK8)、-β2链微管蛋白;③应激相关蛋白:蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3);④信号转导分子:膜联蛋白1(ANX1)、膜联蛋白4(ANX4);⑤分子伴侣:热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白-β1、抑制素(PHB);⑥转录及翻译相关蛋白:不均一性核糖核蛋白H(hnRNP H);⑦杂类:Rgr protein、NPM、PCBP1。结论应用2-DE/MALDI-MS方法获得了较为理想的人肺腺癌细胞系A549细胞2-DE蛋白质表达谱,初步鉴定了15种蛋白质。     

PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞系的差异表达蛋白质组分析

目的研究PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞的蛋白表达差异。方法运用双向电泳技术比较PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞的蛋白表达差异,6个差异蛋白进行胶内酶切后运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析,肽质量指纹图谱检索数据库后5个蛋白得到鉴定。结果同对照PTEN野生型细胞PtenL/LMEFs相比,磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1,PGAM1)和肽脯氨酰顺反异构酶C(pepti-dyl-prolyl cis-trans isomerase C,cyclophilin C)在Pten△/△MEFs细胞中表达上调而Transgelin 2蛋白在Pten△/△MEFs细胞中表达下调。经鉴定已知蛋白点B和F都是过氧化物氧化还原酶6(Peroxiredoxin-6),蛋白点B在Pten△/△MEFs细胞中表达而在Pten△/△MEFs细胞中检测不到,蛋白点B和F的分子质量相似而等电点不同,可能是由于翻译后修饰。结论同对照PTEN野生型细胞PtenL/LMEFs相比,PTEN缺失的Pten△/△MEFs细胞有明显的差异性蛋白表达谱。PTEN的缺失引起细胞内多种蛋白表达改变,这些表达改变的蛋白可能与PTEN缺失后细胞癌变相关。     

三羟基异黄酮抑制乳腺癌细胞生长的质谱研究

目的 初步研究低浓度的三羟异黄酮对人乳腺癌细胞系MCF-7的生长抑制作用,并通过蛋白质组学方法探讨其分子机制.方法 MCF-7细胞在含25μmol/L三羟异黄酮的培养液中分别培养1～7d后,进行MTT实验,测得生长曲线;采用顺序抽提的方法将细胞总蛋白分级为水溶性和疏水性两个组分,并应用双向电泳方法对其进行分离,以获取蛋白质的表达谱;通过软件分析,找出表达量存在显著差异的蛋白质点;再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)与生物信息学相结合的方法对差异表达蛋白点进行分析鉴定.结果 25μmol/L的三羟异黄酮对MCF-7细胞具有明显的抑制作用,并在4d后观察到细胞凋亡现象的出现;双向电泳图谱分析表明无论是水溶性蛋白质还是疏水性蛋白都取得了很好的分离,并成功鉴定出24种差异表达蛋白,其中5种下调,19种上调.结论 这些蛋白质的功能涉及了细胞的生长调节、应激反应、形态和凋亡等多个方面.     

基于液体芯片-飞行时间质谱分析的肺结核患者血清差异表达蛋白

目的应用液体芯片-飞行时间质谱技术分析肺结核患者和正常对照人群的血清蛋白多肽图谱,找出组间具有统计学意义的差异表达蛋白多肽,从而筛选出肺结核的标志蛋白多肽峰图(m/z)。方法应用2种液体蛋白芯片技术(MB-WCX和MB-IMAC-CU)结合飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对14例病理确诊的肺结核患者和32例正常对照人群进行血清蛋白多肽图谱分析;采用ClinProTools软件分析肺结核患者和正常对照组的组间差异表达蛋白。结果 MB-WCX型液体蛋白芯片处理后共获得74个蛋白多肽峰图,其中42个蛋白多肽峰图呈组间极显著差异(P<0.001)表达。MB-IMAC-CU型液体蛋白芯片处理后共获得68个蛋白多肽峰图,有11个蛋白多肽呈组间极显著差异(P<0.001)表达,且其中的8个峰图与MB-WCX型液体芯片检出的组间极显著差异峰图完全相同。经MB-WCX处理所获的42个差异蛋白多肽峰图中有17个蛋白多肽在肺结核患者组中表达上调,其余25个蛋白多肽在肺结核患者组中表达下调。结论利用液体芯片-飞行时间质谱技术可以从肺结核患者的血清中获得稳定丰富的蛋白多肽图谱,并且能够筛选出潜在的疾病标志物。     

Identification of serum biomarkers for diagnosing stage I lung adenocarcinoma by MALDI-TOF mass spectrometry

Objectire To identify specific biomarkers that could improve early diagnsis of lung adenuearcinoma using matrix-assisted laser desorptian/ionization (MALDI) technology. Methods Serum samples were isolated from 17 patients with stage I lung adenuearcinoma and 17 age- and sex-matched healthy controls, and the serum proteomic profiles were obtained by matrix-assistcd laser desorption ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. Results Compared with healthy control group, two highly expressed potential biomarkers were identified with the relative molecular weights of 6 631.64 Da and 4 964. 21 Da. The two best novel protein peaks were automatically chosen for the system training and the development of the constructed model. The constructed model was then used to test an independent set of masked serum samples from 15 lung adenocarcinoma patients and 22 healthy individuals. The analysis yielded a sensitivity of 93.3 %, and a specificity of 95.5 %. Conclusion These results suggest that MALDI-TOF-MS ProteinChip technology is a quick, convenient, and high-output analyzing method that is capable of selecting several relatively potential biomarkers from the serum of lung adenocarcinoma patients and may have a clinical value in the future, and will provide clues to identifying new serologic btomarkers of lung adenocarcinoma.     

应用激光捕获显微切割技术制备肺癌蛋白质组学研究样品

目的探讨应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术获取高同质性肺癌组织细胞及正常对照肺泡上皮细胞的方法及可行性。方法将新鲜肺癌组织标本及其配对正常组织常规制备8μm冰冻切片,采用改良的HE方法染色;应用LCM技术大宗切割肺鳞癌、腺癌及正常对照肺泡上皮细胞;选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞。结果通过LCM技术可以准确、快速地分离癌细胞、间质及其他坏死组织,得到同质性不低于95%的肿瘤细胞和正常细胞。按照Duration 15.5 s的激光脉冲频率和平均8 000 shots条件,既可保证每个帽子的细胞收集数量,也能够有效地缩短实验时间,提高实验可控性,从而使操作过程标准化。结论应用LCM技术可以成功获取同质肺癌细胞和正常细胞。其所需标本量少、组织同质性高、操作过程稳定、可控性好,是肺癌分子生物学及蛋白质组学研究有价值的样品制备方法。     

慢性阻塞性肺疾病患者的血清差异表达蛋白分析

目的应用液体芯片-飞行时间质谱技术从慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的血清中找出差异表达蛋白,筛选出其蛋白多肽(m/z)的疾病标志物。方法应用液体蛋白芯片(MB-WCX)结合飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对16例病理确诊的COPD患者和32例正常对照人群进行血清蛋白组分析。采用ClinProTools软件进行蛋白多肽的组间差异对比,共获得115个蛋白多肽峰图,其中24个蛋白多肽峰图具有极显著差异(P<0.001),其中10个蛋白多肽在COPD患者中表达下调,其余14个蛋白多肽在COPD患者中表达上调。两组数据中最大差异的两个蛋白多肽峰分别是m/z:1 012.92和m/z:4 152.85。结论利用液体芯片-飞行时间质谱技术可以从COPD患者的血清中获得稳定丰富的蛋白多肽图谱,并且能够筛选出潜在的疾病标志物。     

血清胃泌素释放肽前体和神经元烯醇化酶在小细胞肺癌早期诊断中的价值及其相关性

目的探讨胃泌素释放肽前体(progastrinreleasingpeptide,ProGRP)和神经元烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)在小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)早期诊断中的作用及两种标志物之间的相关性。方法分别应用双抗体夹心ELISA法和电化学发光免疫法测定了63例SCLC、41例良性肺疾病及40例非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,NSCLC)患者血清中ProGRP和NSE的水平。结果单个检测ProGRP、NSE及联合检测ProGRP和NSE(ProGRP+NSE)诊断SCLC的特异性分别为88.89%、80.25%及66.67%,敏感性分别为73.02%、63.49%及84.13%;NSCLC中ProGRP和NSE的敏感性分别为12.5%和22.50%;ProGRP+NSE诊断SCLC的敏感性明显高于NSE(P<0.01),但和ProGRP相比,两者差异无显著性(P>0.05);NSE诊断早期SCLC的敏感性仅36.84%,ProGRP及ProGRP+NSE诊断早期SCLC的敏感性分别为63.16%和73.68%,和晚期SCLC(分别为77.27%及88.64%)相比,均无显著性差异(P>0.05);在SCLC中,ProGRP和NSE的相关性较强(χ2=5.00,P<0.05)。结论NSE对SCLC早期诊断价值有限;ProGRP及ProGRP+NSE可能是肺癌分型及SCLC诊断,尤其是早期诊断的较好指标。     

肺耐药相关蛋白表达与非小细胞肺癌血管生成的相关性

目的 探讨肺耐药相关蛋白(LRP)、血管内皮生长因子(VEGF)及微血管密度(MVD)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的变化、相互关系及可能的机制.方法 应用免疫组化技术检测56例NSCLC癌组织和27例正常对照肺组织中LRP、VEGF表达及MVD情况.结果 ①LRP阳性表达分布于癌细胞胞浆内,表达率66.1%,显著高于对照肺组织(P<0.01),其显著性与病理类型无关;NSCLC组LRP的表达在不同性别、TNM分期、有无淋巴结转移及两年生存率的比较上均无明显统计学意义(P>0.05).②与对照组比较,NSCLC组VEGF表达明显升高(P<0.01),其显著性与病理类型无关.NSCLC组VEGF表达与TNM分期、有无淋巴结转移相关(P<0.05).③NSCLC组MVD明显高于对照组(P<0.01),其显著性不受病理类型、病理分级的影响.MVD在Ⅲ+Ⅳ期肺癌中为18.5±5.8,明显高于Ⅰ期的13.8±5.1(P<0.05),有淋巴结转移的高于无淋巴结转移者(P<0.05),两年存活的MVD低于两年死亡的MVD(P<0.01).④NSCLC组VEGF、LRP高表达和MVD增高具有一致性(P<0.05).结论 非小细胞肺癌血管生成与肺耐药相关基因具有一定的相关性.LRP的高表达可能与VEGF上调其基因及VEGF促进肿瘤MVD增加有关.抑制肿瘤新生血管的生成有望降低甚或遏制对非小细胞肺癌化疗的耐药性.