人硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定

目的　克隆人硫氧还蛋白 (HumanThioredoxin ,hTRX)cDNA序列并进行序列测定。方法　应用RT PCR技术 ,以 1 43(TK- )人骨肉瘤细胞RNA为模板 ,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因 ,并克隆至 pGEM TEasy载体中进行基因序列测定。结果　将所得序列与GenBanK(J0 4 0 2 6)提供的序列比较 ,其酶活性中心 (Trp Cys Gly Pro Cys)和基序与已知序列一致 ,第 1 80、2 84位碱基与已知序列不同 ,编码的氨基酸也发生了改变。结论　克隆得编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因 ,为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础。     

SD大鼠Atoh1基因CDS区的克隆及序列分析

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1 cDNA编码序列并测定分析其克隆序列。方法采用非对称互补引物/模板法,制备Atoh1 cDNA的编码序列,将其克隆入PMD-19T载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析表明,扩增得到的大鼠Atoh1基因CDS区全长为1 056 bp,编码351个氨基酸;测定序列与GenBank中公布的参考序列对比,有2处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致。这两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP)位点,突变为无义突变,不影响蛋白的表达。结论成功克隆了Atoh1 cDNA编码序列,为进一步对感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。     

志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列与毒力基因和耐药基因的关系

目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比对等方法获得志贺菌中CRISPR1、CRISPR2和CRISPR-Q1的分布情况、重复序列和间隔序列信息,通过BLAST方法获得毒力基因和耐药基因在志贺菌中的分布情况,SPSS 21.0软件分析CRISPR与毒力基因和耐药基因的关系。结果志贺菌中的CRISPR1和CRISPR2在不同菌株中的间隔序列差别较大,CRISPRQ1分布更为广泛(超过99%)。毒力基因在志贺菌中分布比较广泛(均超过56%),耐药基因中的blaOXA-1、camr、Sul2、tetB分布也比较广(超过50%)。CRISPR1/CRISPR2与是否携带9种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05),CRISPR-Q1与是否携带3种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2和CRISPR-Q1均与志贺菌中存在的毒力基因和耐药基因的个数间有统计学关联(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目之间存在统计学关联(χ2=61.6,P<0.001)。结论志贺菌中不同CRISPR的分布差异比较大,存在的间隔序列数目不等;志贺菌CRISPR与部分毒力基因和耐药基因之间存在负相关;CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目存在正相关。     

DNA序列分析确认1例新的HLA-B等位基因B4814

目的识别确认中国人群中1例新的HLA等位基因。方法使用PCR-SSP和测序为基础的分型技术,分析确认HLA-B*的新等位基因。结果先证者HLA-B位点有一个等位基因的核苷酸序列与已知的HLA等位基因均不同,该基因和B*4812的差异在第3外显子区域的419位碱基A>C,486位碱基C>G,512位碱基G>T。导致116编码子TAC>TCC,编码的氨基酸由酪氨酸(Tyr)变成丝氨酸(Ser),147编码子TGG>TTG,编码的氨基酸由色氨酸(Trp)变成亮氨酸(Leu)。结论该基因为HLA新的等位基因,2005年10月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4814。     

寻常型银屑病患者维甲酸受体α基因第6外显子碱基突变

目的　分析寻常型银屑病患者维甲酸受体α基因序列。方法　选取对维甲酸有不同反应性的寻常型银屑病患者有核细胞 ,提取其基因组DNA ,通过聚合酶链反应扩增维甲酸受体α的第 6外显子序列 ,并对扩增产物进行序列测定。结果　第 6外显子第 93位碱基存在差异 ,出现C→G的改变。但从我们选取的对维甲酸反应性不同的寻常型银屑病患者中 ,未发现彼此间外显子碱基序列存在差异。结论　银屑病患者维甲酸受体α第 6外显子碱基序列发生突变 ,但目前还不能确定突变点在维甲酸反应性差异中的作用     

外排系统与膜通透性的改变对淋球菌高水平多重耐药的影响

目的 探讨外排系统与膜通透性的改变对淋球菌多重耐药的影响.方法 PCR扩增淋球菌mtrR启动子区域包含13 bp回文序列在内的157个碱基片段并进行DNA测序分析;提取外膜蛋白,利用SDS-PAGE进行组成型的分析.结果 5株敏感株的mtrR启动子区域未发生突变,3株高水平多重耐药株的mtrR启动子区域13 bp回文序列均发生了单个A/T碱基的缺失,且均存在外膜孔蛋白表达的缺失.结论 mtrR启动子区域13 bp回文序列单个A/T碱基的缺失引起的mtrCDE外排泵表达增加与外膜孔蛋白表达的缺失或下降导致的膜通透性降低,在介导淋球菌产生高水平多重耐药中起一定的作用.     

miR-497靶向调控疾病易感基因EFNB2的分子机制研究

目的用分子克隆和双荧光素酶报告基因的方法研究miR-497对精神分裂症易感基因EFNB2的靶向调控作用,为miR-497在精神分裂症中的分子功能研究奠定基础。方法运用生物信息学在线软件预测,发现与精神分裂症相关的miR-497可能直接调控疾病易感基因EFNB2。随后采用分子生物学技术扩增EFNB2基因3′-UTR中包含与miR-497种子序列相结合的片段,将该片段连接入pmirGLO质粒载体构建野生型的重组体(WT),并突变EFNB2基因3′-UTR与种子序列相结合的碱基序列,构建突变型的重组体(MUT)。最后将miR-497阴性对照(NC)和模拟物(mimics)分组转染HEK293T细胞系,并在24、48h后分别进行双荧光素酶报告基因活性测定。结果测序结果表明EFNB2基因3′-UTR的野生型(WT)和突变型(MUT)分别成功构建入pmirGLO载体中,表明WT和MUT的重组体均构建成功。转染24、48h后的双荧光素酶报告基因活性检测结果表明,miR-497mimics与NC相比,显著性降低了报告基因的活性。结论本研究在细胞水平证明了miR-497可直接调控精神分裂症易感基因EFNB2,为后续miR-497在精神分裂症中的功能研究提供了新思路和新线索。     

筛选鉴定CD44v9特异性结合肽并用于胃癌检测的研究

目的 筛选并验证CD44v9特异性多肽配体。方法 使用噬菌体展示12肽库筛选固相包被的CD44v9。测序发现待选序列,使用ELISA法进行验证,选择最佳序列合成探针。使用免疫荧光法验证C9-3多肽与CD44v过表达HEK-293细胞的结合,免疫组化法验证多肽探针与胃癌组织的特异性结合力。结果 噬菌体筛选过程中出现明确的富集效应,测序发现30个克隆包含9条序列,其中C9-3序列重复次数最高。ELISA显示9个待选序列中,C9-3序列具有最高的吸光度绝对值及选择力,因此选定为合成探针序列。C9-3探针结合于CD44v过表达HEK-293细胞,而不结合空质粒转染HEK-293细胞。C9-3探针与胃癌组织及癌旁组织结合的免疫组化评分之间存在统计学差异(t=3.953,P<0.01)。胃癌组织中,C9-3探针与CD44v9的组化评分存在线性正相关关系(r=0.823,P<0.01)。结论 本研究成功筛选出CD44v9配体多肽,可以通过CD44v9结合于细胞及胃癌组织,用于胃癌检测的探针。     

基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测

目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌(310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2,并将PCR产物测序;提取CRISPR database数据库中(标准法)100株肠道细菌(47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2序列。使用CRISPR Finder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPR database数据库的CRISPR序列。Clustal X软件进行间隔序列比对。比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性。结果共分析543株肠道细菌,其中75.6%的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5%志贺菌、91.7%沙门菌和95%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1,其间隔序列数目为3~26、2~9、2~32、3。57.1%的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6%志贺菌、85.4%沙门菌和100%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2,其间隔序列数目为1~20、1~6、2~27、1或4个。95%的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90%CRISPR2分别含有3条独特间隔序列(S1-1,S1-2,S1-3)和1条独特间隔序列(S2-1)。间隔序列比对结果显示,S1-1+S1-2+S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100%和99.6%。标准法检测和PCR扩增CRISPR1和CRISPR2检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性分别达99.6%和99.3%。基于CRISPR检测大肠埃希菌O157∶H7在模拟样品中的应用,结果显示在原样品大肠埃希菌O157∶H7浓度约2.3CFU/mL时,经12h增菌后即能检测出来。大肠埃希菌O157∶H7聚类分析显示,40株O157∶H7大肠埃希菌可分为3类。结论基于CRISPR的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法,可以作为监测大肠埃希菌O157∶H7感染和高毒株大肠埃希菌O157∶H7有价值的流行病学工具。     

THE CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-3 GENE

Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）ｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｆａｍｉｌｙｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｙｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ〔１〕．Ｔｈｅｇｅｎｅｏｆｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ｈＮＴ－３）ｉｓｌｏｃａ...     

MOLECULAR CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-4 GENE

Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ 4 (ＮＴ 4 )ｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｈｅｎｅｕ ｒｏｔｒｏｐｈｉｎｆａｍｉｌｙｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ[1] ,ｔｈａｔａｌｓｏｉｎｃｌｕｄｅｓｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ 3(ＮＴ 3) ,ｎｅｕ ｒｏｔｒｏｐｈｉｎ 6 (ＮＴ 6 ) ,ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ (ＮＧＦ)ａｎｄｂｒａｉｎ ｄｅｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ (ＢＤＮＦ) [2 - 6] ,ｗｈｉｃｈｓｕｐｐｏｒｔｓｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｎｅｕｒｏｎｓ[7] .Ａｔｐｒｅ…     

人脑源性神经营养因子基因克隆及序列分析

目的　克隆人脑源性神经营养因子 (hBDNF)基因并进行序列分析。方法　提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板 ,应用PCR技术和T 载体克隆法克隆hBDNF基因 ,筛选阳性克隆、酶切鉴定 ,并进行序列测定和分析。结果　DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列 (M6 1 1 81 )比较 ,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744bp ,序列完全相同。结论　自人基因组DNA中克隆hBDNF基因 ,为进一步开展阿尔茨海默病 (AD)的基因治疗积累了资料。     

CLONING AND SEQUENCING OF MATURED FRAGMENT OF HUMAN NEVER GROWTH FACTOR GENE

Humannervegrowthfactor (hNGF)istheear liestrevealedcellulargrowthregulator.Researchershaveattainedafairlygoodunderstandingofthisnu tritionalfactorthatisessentialtothesurvival,growthanddifferentiationofcentralandperipheralnerves.Theclinicaluseofnerve growthfactor(NGF)hasapotentialtorepairorregrowdamagednerves,topreventandtreatretrogradeneurologicaldiseases,andto promotedifferentiationofneuro blast .Thepreviousstudieshaveshownthatdirectpu rificationofNGFisdifficultandoflessproductionwhilegen…     

ADENO-ASSOCIATED VIRUS INTRODUCED INTEGRATION AND EXPRESSION OF FOREIGN GENES IN PC12 CELLS

The ability to induce the expression of targetgenes in neurons is a goal of molecular neurobiolo-gy up to now. A variety of means including lipo-somes and recombinant retrovirus vectors and re-combinant adenovirus vectors have been used to ac-coplish this goal. Each method has some specificdisadvantages['J. None can provide reliable andcontinuouk gene expression in neurons of the cen-tral nervous system.Vectors derived from adeno--associaed virus(AAV ) have the potential to stably transducem…     

人神经生长因子的基因克隆和序列分析

目的　克隆人神经生长因子基因编码区。方法　由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ,利用PCR法 ,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段 ;将获得的基因片段插入 pGEM T Easy质粒中 ,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果　经质粒DNA酶切分析及序列测定 ,获得了人神经生长因子DNA片段序列。结论　首次由人白细胞DNA中克隆获得了人神经生长因子基因 ,为神经生长因子的基因治疗提供了前提条件。     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达     

亚硒酸钠对小鼠脾细胞DNA合成的影响

本文通过1次和多次给小鼠不同剂量的亚硒酸钠,以~3H-TdR掺入脾细胞DNA为指标,同时进行全血硒浓度测定,观察了补硒对小鼠体内细胞DNA合成的影响以及与血硒浓度的关系。结果表明:①亚硒酸钠对脾细胞DNA合成呈双相作用,低剂量促进其合成,高剂量则产生毒性抑制作用,毒性作用短暂、可逆,与1次大剂量有关。②多次给硒,最终血硒浓度与毒性作用之间不呈正相关。③补硒的单次剂量和方式影响稳态血硒浓度水平。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步免疫观察

目的　构建用于防治单纯疱疹的核酸疫苗并观察其免疫效果。方法　用PCR反应 ,从HSV 1F株基因组DNA中扩增出 gD蛋白的全部编码序列 ,将其插入 pcDNA 3 1 (+)的PCMV下游 ,构建HSVgD核酸疫苗 ,并用酶切分析和测序鉴定 ;通过中和试验、ELISA方法和攻击试验检测用 pLy D三次肌肉接种小鼠的免疫效果。结果　经鉴定证实了HSV gD核酸疫苗 pLy D的构建 ;实验小鼠产生了对HSV 1特异性的抗体 (抗体滴度 :ELISA法 1∶2 0 3,中和试验法 1∶37) ,并经受了HSV 1病毒的攻击 (存活率 :70 % )。结论　成功构建出了HSV gD核酸疫苗pLy D ,用其接种小鼠可以诱导产生特异性免疫反应 ,并具有良好的保护作用。     

Anti-CD3 scFv-B7.1真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的初步表达

目的　构建anti CD3scFv B7.1真核表达载体 ,并进行初步表达。方法　采用重叠延伸拼接法 (splicingbyoverlapextention ,SOE)将anti CD3scFv和B7.1(V +C)两个基因片段通过spacer序列连接 ,将融合基因克隆入T载体 ,并测序证实。在此基础上构建真核表达载体pcDNA/anti CD3scFv B7.1,并经脂质体法转染COS 7细胞 ,免疫组织化学法检测表达。结果　获得了序列与预期完全相同的融合基因 ;构建了抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ;在COS 7细胞中获得初步表达。结论　成功构建及表达抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ,为进一步研究抗CD3scFv B7.1双功能分子的生物学活性及用于肿瘤生物治疗奠定了基础